Αναπαραγωγή του E.coli σε θρεπτικά μέσα και οι παράγοντες του. Θρεπτικό μέσο για την καλλιέργεια βακτηρίων του γένους pseudomonas Πυκνότητα του παρασκευασμένου μέσου

Η αναπαραγωγή του E. coli υπό τυπικές συνθήκες μπορεί να περιγραφεί με μια καμπύλη, η οποία αντιπροσωπεύει την εξάρτηση του αριθμού των κυττάρων E.coliσε αναστολή από τη στιγμή της ανάπτυξης (βλ. σχήμα στην παρουσίαση). Αριθμός κυττάρων E.coliσε εναιώρημα είναι ισοδύναμη με την οπτική πυκνότητα μιας καλλιέργειας E. coli μετρημένη στα 600 nm («θολερότητα εναιωρήματος»). Καμπύλη αναπαραγωγής E.coliπεριλαμβάνει 4 κύριες φάσεις: (αρχική φάση, φάση υστέρησης), εκθετική φάση (εκθετική, λογαριθμική φάση), στατική φάση (στάσιμη φάση) και φάση θανάτου. Κατά την αρχική φάση ανάπτυξης, η αύξηση της κυτταρικής βιομάζας συμβαίνει πολύ αργά. Αυτό οφείλεται στον αρχικά μικρό αριθμό κυττάρων. Όταν η οπτική πυκνότητα του εναιωρήματος φτάσει περίπου το 0,1, η ανάπτυξη του E. coli εισέρχεται στην εκθετική φάση - τη φάση της ταχείας ανάπτυξης. Διαπιστώθηκε ότι κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης, η οπτική πυκνότητα της καλλιέργειας διπλασιάζεται κατά μέσο όρο κάθε 30 λεπτά. Όταν η οπτική πυκνότητα του εναιωρήματος γίνει περίπου 1,5, λόγω του μεγάλου αριθμού κυττάρων και της μικρής ποσότητας θρεπτικών ουσιών στο μέσο, ​​η ανάπτυξη E.coliεπιβραδύνει σημαντικά και εισέρχεται στη στατική φάση. Και τέλος, ένας υπερβολικά μεγάλος αριθμός κυττάρων στο εναιώρημα, η σχεδόν πλήρης εξάντληση του θρεπτικού μέσου και η υψηλή συγκέντρωση βακτηριακών μεταβολιτών σε αυτό οδηγούν στον θάνατο των βακτηριακών κυττάρων, στη λύση τους και στη μείωση της πυκνότητας της βακτηριακής καλλιέργειας ( φάση θανάτου).

Τυπικές συνθήκες ανάπτυξης E.coliστο εναιώρημα υπάρχουν οι ακόλουθες παράμετροι: θρεπτικό μέσο LB-broth, θερμοκρασία 37 °C, εντατική ανάδευση (τουλάχιστον 150 rpm) και επαρκής αερισμός. Πρέπει να σημειωθεί ότι η ανάπτυξη E.coliείναι δυνατό όχι μόνο σε εναιώρημα, αλλά και σε λεγόμενα στερεά θρεπτικά μέσα που περιέχουν άγαρ. Σε αυτή την περίπτωση, δεν απαιτείται εντατική ανάμειξη.

Θρεπτικά μέσα για την ανάπτυξηE.coli .

Υγρά μέσα καλλιέργειας. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο μέσο ανάπτυξης είναι E.coliσε εναιώρημα είναι το μέσο LB-ζωμού (μέσο Luria Bertani, ζωμός lysogeny). Αυτό το εξαιρετικά θρεπτικό μέσο και τα κύρια συστατικά του είναι η τρυπτόνη ή πεπτόνη, το εκχύλισμα μαγιάς και το NaCl. Η τρυπτόνη (πεπτόνη) είναι προϊόντα υδρόλυσης καζεΐνης υπό τη δράση της θρυψίνης (πεψίνης) και χρησιμεύουν ως πηγές αμινοξέων και πεπτιδίων. Το εκχύλισμα μαγιάς είναι πηγή άνθρακα, βιταμινών (συμπεριλαμβανομένης της ομάδας Β), καθώς και μετάλλων όπως ιόντα μαγνησίου, θείου και ασβεστίου. και το NaCl παρέχει στα βακτηριακά κύτταρα ιόντα Na + για την αποτελεσματική μεταφορά και τη διατήρηση της οσμωτικής ισορροπίας. Για να παρασκευάσετε το μέσο LB, διαλύστε 10 g τρυπτόνης, 5 g εκχύλισμα μαγιάς και 10 g NaCl (ή 25 g έτοιμο μείγμα) σε 1 λίτρο νερού, βάλτε σε αυτόκλειστο και ψύξτε. Πρέπει να σημειωθεί ότι η ανάπτυξη διαφόρων στελεχών E.coliστο μέσο LB εμφανίζεται με διαφορετικούς ρυθμούς και ορισμένα στελέχη είναι πολύ ευαίσθητα σε υψηλή περιεκτικότητα σε NaCl. Είναι γνωστό ότι το NaCl σε συγκέντρωση 10% μπορεί να έχει ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη ορισμένων στελεχών του E. coli. Από την άποψη αυτή, αναπτύχθηκαν πρωτόκολλα για μέσο άλατος LB (5 g NaCl/L LB) και χαμηλής περιεκτικότητας σε αλάτι μέσο LB (0,5 g NaCl/L) με πανομοιότυπα περιεχόμενα πεπτόνης και εκχυλίσματος ζυμομύκητα. Η χαμηλής περιεκτικότητας σε αλάτι έκδοση του μέσου LB χρησιμοποιείται επίσης εάν ένα αντιβιοτικό ευαίσθητο σε υψηλές συγκεντρώσεις άλατος πρόκειται να προστεθεί στο μέσο ανάπτυξης. Το pH του μέσου LB χωρίς πρόσθετη ρύθμιση είναι περίπου 7,0 – 7,2.

Κανονικά, για να επιτευχθεί η στατική φάση, μεγαλώστε E.coliθα πρέπει να είναι 14-18 ώρες, ωστόσο, μερικές φορές προκύπτουν καταστάσεις όταν είναι απαραίτητο να αναπτυχθεί E.coliγια αρκετές ημέρες (για παράδειγμα, για την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων βιομάζας κατά την έκφραση πρωτεΐνης). Σε αυτή την περίπτωση, η χρήση του μέσου LB δεν είναι αποτελεσματική, καθώς υπάρχει εξάντληση των θρεπτικών ουσιών και μείωση του pH του μέσου που προκαλείται από υψηλή συγκέντρωση μεταβολιτών, η οποία προκαλεί τον κυτταρικό θάνατο και αναστέλλει την ανάπτυξή τους. Σε τέτοιες περιπτώσεις, για ανάπτυξη E.coliχρησιμοποιήστε άλλα μέσα που περιέχουν πρόσθετα θρεπτικά συστατικά και ρυθμιστικά συστήματα για τη διατήρηση του pH. Για να αυξηθούν τα θρεπτικά συστατικά, τα περισσότερα από αυτά τα μέσα περιέχουν διπλάσια ή τριπλάσια ποσότητα τρυπτόνης και εκχυλίσματος μαγιάς. Επιπλέον, ορισμένα μέσα περιλαμβάνουν: γλυκερίνη ή γλυκόζη ως πρόσθετες πηγές άνθρακα (TB, μέσα SOC), ένα ρυθμιστικό σύστημα φωσφορικών ή CaCO 3, που εμποδίζουν την οξίνιση του μέσου και διατηρούν το pH του στη στατική φάση ανάπτυξης E.coli(περιβάλλον TB), καθώς και άλατα Mg 2+ και K + (περιβάλλοντα 2*YT, SOB, SOC).

Για ανάπτυξη E.coliΤα υγρά μέσα καλλιέργειας συνήθως χρησιμοποιούν προαποστειρωμένες ή επεξεργασμένες με αλκοόλ κωνικές γυάλινες φιάλες ή πλαστικούς σωλήνες Falcon 50 ml. Επέκταση βιομάζας E.coliγια την επακόλουθη απομόνωση του πλασμιδικού DNA, συνήθως πραγματοποιείται κατά τη διάρκεια της νύχτας, δηλ. λαμβάνεται μια καλλιέργεια «ολονύκτιας». Για να γίνει αυτό, μια μικρή ποσότητα βακτηρίων προμετασχηματισμένων με ένα πλασμίδιο τοποθετείται σε μια φιάλη ή πλαστικό σωλήνα με ένα μέσο παρουσία του απαιτούμενου αντιβιοτικού και η καλλιέργεια αναπτύσσεται στους 37°C και 150 rpm για 14-18 ώρες. . Η τελική «ολονύκτια» καλλιέργεια είναι ένα θολό εναιώρημα κυττάρων στο μέσο. Για την υλοποίηση ορισμένων εργασιών (για παράδειγμα, απόκτηση ικανών κυττάρων ή έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών), είναι απαραίτητο να αναπτυχθούν κύτταρα σε ορισμένες τιμές OD600 (συνήθως 0,3 – 0,8). Σε τέτοιες περιπτώσεις, είναι απαραίτητο να παρακολουθείται η οπτική πυκνότητα της αναπτυσσόμενης καλλιέργειας, ώστε να μην χάνεται η στιγμή της επίτευξης της επιθυμητής οπτικής πυκνότητας.

Στερεά θρεπτικά μέσα.Χρησιμοποιείται στερεό θρεπτικό μέσο όταν είναι απαραίτητο να ληφθούν μεμονωμένες αποικίες E.coli. Αυτό απαιτείται συνήθως όταν τα κύτταρα μετασχηματίζονται με ένα ετερογενές μίγμα πλασμιδικού DNA (για παράδειγμα, στην περίπτωση ενός μίγματος λιγάσης) και είναι απαραίτητο να βρεθεί μια αποικία που περιέχει τη σωστή παραλλαγή του πλασμιδίου. Τυπικά στην περίπτωση στερεών μέσων ανάπτυξης E.coliχρησιμοποιήστε πλαστικά ποτήρια μιας χρήσης με διάμετρο 90 mm. Το πιο κοινό στερεό μέσο καλλιέργειας είναι 1,5% άγαρ που παρασκευάζεται σε LB (LB agar). Για την παρασκευή 1 λίτρου τέτοιου μέσου, 15 g άγαρ, 10 g τρυπτόνης, 5 g εκχυλίσματος μαγιάς και 10 g NaCl (ή 25 g του παρασκευασμένου μείγματος LB) πρέπει να διαλυθούν σε 1 λίτρο απεσταγμένου νερού και να αποστειρωθούν σε αυτόκλειστο. . Το άγαρ πρέπει να κρυώσει σε θερμοκρασία 50°C - 60°C, να προστεθεί το απαιτούμενο αντιβιοτικό, να χυθεί σε φλιτζάνια με περίπου 10 ml ανά φλιτζάνι και να αφεθεί να σκληρύνει κάτω από ένα έλασμα δίπλα στον καυστήρα, με το καπάκι. ελαφρώς ανοιχτό. Μόλις εξατμιστεί η συμπύκνωση, το κύπελλο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον ενοφθαλμισμό βακτηρίων.

Θερμοκρασία.Με τη μείωση της θερμοκρασίας αυξάνεται E.coliεπιβραδύνει, αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις το E. coli καλλιεργείται σε χαμηλότερες θερμοκρασίες για αρκετές ημέρες, όπως όταν μαγειρεύεται από καλλιέργεια E.coliικανά κύτταρα ή κατά την έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών.

Ανάδευση και αερισμός.Για να εξασφαλίσετε επαρκή αερισμό, μεγαλώστε E.coliΣε εναιώρηση είναι απαραίτητο με εντατική ανάδευση (τουλάχιστον 150 rpm) και το δοχείο (φιάλη ή πλαστικός δοκιμαστικός σωλήνας) πρέπει να γεμίσει με το μέσο έως το 1/10 του συνολικού όγκου κατ' ανώτατο όριο. Για να βελτιωθεί ο αερισμός, τα καπάκια των σωλήνων που χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη της βακτηριακής καλλιέργειας κλείνουν χαλαρά και χρησιμοποιείται αλουμινόχαρτο για το κλείσιμο των φιαλών. Σε ορισμένες περιπτώσεις, χρησιμοποιούνται φιάλες με ειδικές εσωτερικές λεπίδες - "προφυλακτήρες". Κατά την ανάδευση σε τέτοιες φιάλες, η επιφάνεια επαφής μεταξύ του μέσου και του αέρα αυξάνεται αισθητά λόγω του πιτσιλίσματος του υγρού. Όσο περισσότεροι προφυλακτήρες στη φιάλη, τόσο ισχυρότερο είναι το πιτσίλισμα του υγρού και τόσο υψηλότερος ο αερισμός. Σε περίπτωση ανάπτυξης E.coliσε ένα στερεό θρεπτικό μέσο, ​​ο αερισμός συμβαίνει λόγω του γεγονότος ότι παρέχεται κάποιος χώρος μεταξύ των τοιχωμάτων του βακτηριακού δίσκου και του καπακιού για τη διείσδυση αέρα.

ΑντιβιοτικάΌπως αναφέρθηκε παραπάνω, τα περισσότερα πλασμίδια περιέχουν ένα γονίδιο ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά, παρουσία του οποίου υπάρχει μια επιλογή κυττάρων που περιέχουν το πλασμίδιο από κύτταρα που δεν το περιέχουν. Τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα αντιβιοτικά για επιλογή είναι η αμπικιλλίνη (συγκέντρωση εργασίας - 100 μg/ml), η καναμυκίνη (συγκέντρωση εργασίας - 30 μg/ml) και η χλωραμφενικόλη (συγκέντρωση εργασίας - 25-30 μg/ml). Τα αντιβιοτικά συνήθως διαλύονται σε αιθανόλη ή νερό (κάθε αντιβιοτικό έχει τις δικές του συνθήκες διαλυτότητας), παρασκευάζονται χιλιοπλάσια μητρικά διαλύματα και αποθηκεύονται στους -20°C. Πριν προσθέσετε αντιβιοτικά στο άγαρ LB, είναι απαραίτητο να το ψύξετε στους 50-60°C, αφού τα αντιβιοτικά καταστρέφονται εύκολα σε υψηλές θερμοκρασίες. Ορισμένα αντιβιοτικά, όπως η αμπικιλλίνη, είναι φωτοευαίσθητα, επομένως είναι σκόπιμο να αναπτυχθούν βακτήρια παρουσία τους στο σκοτάδι.

Αυτά τα μέσα χρησιμοποιούνται για την καλλιέργεια και την αποθήκευση ανασυνδυασμένων στελεχών Escherichia coli, καθώς και για τη συνήθη καλλιέργεια όχι πολύ απαιτητικών μικροοργανισμών.

Χημική ένωση**:

** Η σύνθεση έχει επαληθευτεί και προσαρμοστεί ώστε να πληροί τις απαιτούμενες παραμέτρους

Παρασκευή:

Αναμείξτε 35,0 g σκόνης M557 ή 20,0 g σκόνης M575 ή 40,0 g σκόνης M1151 ή 25,0 g σκόνης M1245 σε 1000 ml απεσταγμένου νερού. Ζεσταίνουμε για να διαλυθούν εντελώς τα σωματίδια. Αποστειρώστε σε αυτόκαυστο σε 1,1 atm (121°C) για 15 λεπτά. Αδειάζουμε σε κατάλληλα δοχεία.

Αρχή και αξιολόγηση του αποτελέσματος:

Το άγαρ και ο ζωμός Luria παρασκευάζονται σύμφωνα με τη συνταγή Lennox (1) για την καλλιέργεια και αποθήκευση ανασυνδυασμένων στελεχών Escherichia coli. Τα υπόλοιπα μέσα (2) είναι ελαφρώς διαφορετικά στο ότι έχουν διπλάσια συγκέντρωση χλωριούχου νατρίου. Αυτά τα μέσα περιέχουν επαρκή θρεπτικά συστατικά για την ανάπτυξη ανασυνδυασμένων στελεχών. Τέτοια στελέχη είναι συνήθως παράγωγα Escherichia coliΚ12, ανεπάρκεια στη σύνθεση της βιταμίνης Β. Εξαιτίας αυτού και άλλων δεικτών αυξοτροφίας που λαμβάνονται κατά τη μεταλλαξογένεση, τα ανασυνδυασμένα στελέχη μπορεί να χάσουν την ικανότητα να αναπτύσσονται σε μέσα με εξαντλημένη σύνθεση.

Η υδρόλυση καζεΐνης εξασφαλίζει την παρουσία πεπτιδίων στο μέσο, ​​εκχύλισμα ζύμης - βιταμίνες Β, χλωριούχο νάτριο - ιόντα νατρίου για μεταφορά στη μεμβράνη και διατήρηση της βέλτιστης οσμωτικής πίεσης.

Ελεγχος ποιότητας:

Εμφάνιση σκόνης:

Ομοιογενής, ελεύθερα ρέουσα ανοιχτοκίτρινη σκόνη.

Πυκνότητα τελικού μέσου:

Σχηματίζεται ένα μέσο που αντιστοιχεί σε πυκνότητα σε γέλη άγαρ 1,5% (Μ557 ή Μ1151).

Χρώμα και διαφάνεια του τελικού μέσου:

Το υλικό είναι κίτρινο ή πορτοκαλί χρώματος, διαφανές ή ελαφρώς ιριδίζον εάν σχηματιστεί γέλη σε δοκιμαστικούς σωλήνες ή τρυβλία Petri.

Οξύτητα του περιβάλλοντος:

Στους 25°C, τα υδατικά διαλύματα M557 (3,5% w/v) ή M575 (2,0% w/v) έχουν pH 7,0 ± 0,2 και τα υδατικά διαλύματα M1151 (4,0% w/v) ή M1245 (2,5% w/v) έχουν pH 7,5 ± 0,2.

Θέμα: Απομόνωση και καθαρισμός πρωτεΐνηςpkb5

πειραματικό μέρος

Στελέχη και μέσα.

Το στέλεχος που χρησιμοποιείται σε αυτή την εργασία μι. coliB.L.21(DE3) pLysS, με πλασμίδιο pET32a:Pkb5 (Σχήμα), που περιέχει την καταλυτική περιοχή της κινάσης πρωτεΐνης Bifidobacterium longum pkb5.

Για την ανάπτυξη των κυττάρων μι. coliΧρησιμοποιήθηκαν θρεπτικά μέσα LB και TB.

Πίνακας 1 - Θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιούνται για την καλλιέργεια μι. coli

Τα μέσα αποστειρώθηκαν σε αυτόκλειστο σε περίσσεια πίεση 0,8 atm για 40 λεπτά.

Για τη διατήρηση της καταπόνησης μι. coliB.L.21(DE3) pLysS, που περιέχει το πλασμίδιο pET32a:Pkb5, πραγματοποιήθηκε μονοκλωνικό κοσκίνισμα σε τρυβλία Petri με μέσο άγαρ LB με προσθήκη χλωραμφενικόλης (30 μg/ml) και αμπικιλλίνης (150 μg/ml).

Για τη δημιουργία κυτταρικής βιομάζας μι. coliB.L.21(DE3) pLysS, που περιέχει το πλασμίδιο pET32a:Pkb5, αναπτύχθηκαν σε φιάλες σε μέσο TV με την προσθήκη χλωραμφενικόλης και αμπικιλλίνης.

Στο πρώτο στάδιο, οι νυχτερινές καλλιέργειες καλλιεργούνταν σε τηλεοπτικό μέσο. Στο δεύτερο στάδιο, 1,5 ολονύκτια καλλιέργειες προστέθηκαν σε φιάλες με 150 ml φρέσκου μέσου. Η ανάπτυξη διεξήχθη υπό συνθήκες αερισμού στις 250 rpm και θερμοκρασία 37 0 C μέχρι την οπτική πυκνότητα OD 600 = 0,6 (~ 2 ώρες), στη συνέχεια η έκφραση προκλήθηκε με προσθήκη IPTG (ισοπροπυλ - β-D-θειογαλακτοσίδη) σε ένα τελικό συγκέντρωση 0,5 mm. Στη συνέχεια, η καλλιέργεια πραγματοποιήθηκε στους 28 0 C για 18 ώρες, μετά την οποία η βιομάζα σφαιροποιήθηκε με φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στις 6.000 rpm, πλύθηκε με 1 Μ Tris-HCl (ρΗ 7,6-8,0) και καταψύχθηκε στους -20 0 C.

Ρύζι. Σχέδιο κατασκευής πλασμιδίου pET32a: Pkb5 .

Παρασκευή του λύματοςμι .Με oli

Αποψυγμένα κύτταρα μι.Μεoliσε θερμοκρασία 4 0 C. Τα αποψυγμένα κύτταρα πλύθηκαν από το μέσο ανάπτυξης με 20 όγκους (18 ml) 1 Μ Tris-HCl, ρΗ 7,8. Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση στις 7500 rpm για 10 λεπτά σε θερμοκρασία 4 0 C. Το βάρος του ιζήματος προσδιορίστηκε σε 1,61 g σε αναλυτικό ζυγό Τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 10 όγκους ρυθμιστικού διαλύματος λύσης που περιείχε 300 mM KCl , 50 mM KH 2 PO 4, 5 mM Imidazole, 6 M κοκτέιλ αναστολέα ουρίας (πλήρης χωρίς EDTA, Roche Diagnostics Gmbh, Γερμανία). Τα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας έναν υπερηχητικό αποσαθρωτή SONICS VIBRA CELL 3 φορές για 59 δευτερόλεπτα με ένα διάστημα 15 δευτερολέπτων σε πλάτος 40% και θερμοκρασία 4 0 C. Για να καθιζάνουν θραύσματα κυτταρικού τοιχώματος, το προϊόν λύσης φυγοκεντρήθηκε στις 10.000 rpm για 2 λεπτά σε θερμοκρασία 4 0 C Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και διηθήθηκε μέσω φίλτρου (διάμετρος πόρων 0,22 μm, Merck Millipore Ltd, Γερμανία) αμέσως πριν την εφαρμογή στη στήλη.

Χρωματογραφία συγγένειας μετάλλων

Η μέθοδος χρωματογραφίας συγγένειας μετάλλου βασίζεται στη μη ομοιοπολική αλληλεπίδραση του θραύσματος 6 ιστιδίνης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης (His-Tag) με ιόντα νικελίου (Ni 2+), σχηματίζοντας δεσμούς συντονισμού με υπολείμματα νιτροοξικού οξέος.

Ο καθαρισμός διεξήχθη σε έναν συλλέκτη κλασμάτων Bio Logic LP Model 2110 (Bio Rad, ΗΠΑ) χρησιμοποιώντας στήλη 1 ml Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges.

Ο καθαρισμός πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το εγχειρίδιο μεθόδου Profinite IMAC Resins (Bio Rad, ΗΠΑ).

Πριν από την έναρξη της εργασίας, το σύστημα πλύθηκε με απεσταγμένο νερό, εγκαταστάθηκε μια στήλη Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges και η στήλη πλύθηκε με απεσταγμένο νερό με ταχύτητα 2 ml/min. Η στήλη εξισορροπήθηκε με 8 όγκους ρυθμιστικού διαλύματος λύσης με ρυθμό 2 ml/min, το προϊόν λύσης εφαρμόστηκε σε όγκο 15 ml με ρυθμό 0,5 ml/min, πλύθηκε με 15 όγκους ρυθμιστικού διαλύματος λύσης με ρυθμό 2 ml /λεπτό, στη συνέχεια πλύθηκε με 15-3 όγκους ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης με ρυθμό 2 ml/min, η έκλουση πραγματοποιήθηκε με 15 όγκους ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης με ρυθμό 2 ml/min. Τα κλάσματα συλλέχθηκαν σε όγκους των 2 ml. Τα κλάσματα που αντιστοιχούν στην εκλουσθείσα πρωτεΐνη συλλέχθηκαν χωριστά.

Στο τέλος της εργασίας, η στήλη πλύθηκε με 2 ml απεσταγμένου νερού με ρυθμό 2 ml/min και αναδημιουργήθηκε με 5 όγκους 6 Μ γουανιδίνης-HCl και στη συνέχεια με απεσταγμένο νερό. Η στήλη που χρησιμοποιήθηκε αποθηκεύτηκε σε αιθανόλη 20% στους 4 0 C.

Σύνθεση ρυθμιστικού διαλύματος

Προσδιορισμός της ποσότητας πρωτεΐνης

Οι ποσότητες πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bradford (Bradford Μ.Μ., 1976).

Χρησιμοποιώντας ένα ψηφιακό φασματοφωτόμετρο PD-303, προσδιορίστηκε η οπτική πυκνότητα σε μήκος κύματος 595 nm για τα κλάσματα 31 και 32 και η ποσότητα πρωτεΐνης προσδιορίστηκε από το γράφημα (Σχήμα) και υπολογίστηκε η συγκέντρωση.

Σύνθεση βαφής: 100 mg CBB (Coomassie Brilliant Blue G-250), 95% C 2 H 5 OH, 85% H 3 PO 4

Ρύζι. Γράφημα για τον προσδιορισμό της ποσότητας του δείγματος δοκιμής χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Breedford

Σταδιακή αιμοκάθαρση

Οι σωλήνες αιμοκάθαρσης που χρησιμοποιήθηκαν στην εργασία ήταν SnakeSkin Pleated Dialysis Tubing (Thermo Scientific), διάμετρος πόρων 3.500 MVCO.

Τα επιλεγμένα κλάσματα υποβλήθηκαν σε διαπίδυση έναντι ενός ρυθμιστικού διαλύματος που περιείχε 50 mM Tris-HCl, 5 mM β-μερκαπτοαιθανόλη, 10% γλυκερίνη, 3 Μ ουρία σε θερμοκρασία 4 0 C για 2,5 ώρες με συνεχή ανάδευση. Στη συνέχεια, το ρυθμιστικό διάλυμα αιμοκάθαρσης αντικαταστάθηκε με ένα ρυθμιστικό διάλυμα αιμοκάθαρσης που περιείχε 50 mM Tris-HCl, 5 mM β-μερκαπτοαιθανόλη, 10% γλυκερίνη, 1,5 Μ ουρία, 2 mM MgCl2. Αφήνουμε όλη τη νύχτα με συνεχή ανάδευση στους 4 0 C.

Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός πρωτεϊνών σε μετουσιωτική γέλη SDS-πολυακρυλαμιδίου

Η ηλεκτροφόρηση διεξήχθη σύμφωνα με τη μέθοδο Laemmli (Laemmli U. Κ., 1970) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Mini πρωτεάμ. Ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 12% σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0,375 Μ Tris-HCl ρΗ 8,8, 0,1% SDS χρησιμοποιήθηκε ως γέλη εργασίας· ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 3% που περιείχε 0,125 Μ Tris-HCl ρΗ 6,8 χρησιμοποιήθηκε ως γέλη σχηματισμού 0,1% SDS .

Το ρυθμιστικό ηλεκτροδίου ήταν 0,025 Μ Tris, 0,192 Μ γλυκίνη, 0,1% SDS.

Πριν από την εφαρμογή, τα δείγματα θερμάνθηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0,0625 Μ Tris-HCl ρΗ 6,8, 2,3% SDS, 5% β-μερκαπτοαιθανόλη, 10% γλυκερίνη και 0,001% βρώμιο μπλε φαινόλης. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε σε σταθερή τάση 200 βολτ. Στο τέλος της ηλεκτροφόρησης, η PAGE σταθεροποιήθηκε για 30 λεπτά σε διάλυμα που περιείχε 50% C2H5OH και 10% CH3COOH. Στη συνέχεια, η χρώση πραγματοποιήθηκε σε ένα διάλυμα που περιείχε 0,2% SBB g-250, 40% C2H5OH, 8% CH3COOH με θέρμανση. Το PAGE πλύθηκε σε 7% CH3COOH.

Συγκέντρωση

Για να μετρηθεί περαιτέρω η δραστηριότητα της καταλυτικής περιοχής pkb 5, η εκλουσθείσα πρωτεΐνη συμπυκνώθηκε χρησιμοποιώντας Amicon Ultra Centrifugal Filters, διαμέτρου πόρων 50.000 NMWL (Merck Millipore Ltd).

Η συμπύκνωση του δείγματος πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας φυγοκέντρηση Eppendorf 5430 R στις 7500 rpm για 1 ώρα και 20 λεπτά σε θερμοκρασία 4 0 C.

Έλεγχος δραστηριότητας

Ο προσδιορισμός της αυτοφωσφορυλίωσης της pkb 5 (ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη) διεξήχθη χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Kinase-Glor Plus Luminiscent Kinase (Promega V3772), που χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της έκτασης της φωσφορυλίωσης από το επίπεδο ΑΤΡ που απομένει κατά τη διάρκεια της αντίδρασης.

Χρησιμοποιώντας έναν αυτοματοποιημένο σταθμό εργασίας Biomek 3000 Beckman Coulter©, 15 μl διαλύματος pkb 5 (5 μg και 1 μg στο μείγμα αντίδρασης) σε ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης (15 mM HEPES pH 7,4, 20 mM NaCl, 10 mM MgCl 2, 0,5 mM MgCl 2 , 0,5 mM MgCl 2 , 0,5 mM με χρήση ενός αυτοματοποιημένου σταθμού εργασίας Biomek 3000 Beckman Coulter© (5 μg και 1 μg στο μείγμα αντίδρασης) 0,02% Tween-20, 10 mg/ml BSA) και 15 μl ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης (μάρτυρας χωρίς κινάση πρωτεΐνης).

20 μΜ ATP (15 μl) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και τα περιεχόμενα των φρεατίων αναμίχθηκαν. Επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, καλύπτοντας την πλάκα με ένα καπάκι για να αποφευχθεί η εξάτμιση.

Στο τέλος της ενζυματικής αντίδρασης, 30 μl αντιδραστηρίου για τον προσδιορισμό της φωταύγειας προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, η πλάκα επωάστηκε για 40 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και η φωταύγεια μετρήθηκε σε Beckman Coulter© DTX 880 Multimode Detector.

Η συζήτηση των αποτελεσμάτων

Στο στάδιο της χρωματογραφίας συγγένειας μετάλλου, προσδιορίστηκε από το χρωματογράφημα ότι η πρωτεΐνη pkb 5 που μελετήθηκε περιείχε τα κλάσματα 31 και 32.

Σχ. Χρωματόγραμμα της απομόνωσης της καταλυτικής περιοχής pkb 5

Τα κλάσματα 31 και 32 συνδυάστηκαν επειδή περιείχαν την υπό μελέτη πρωτεΐνη.

Εφόσον η καταλυτική περιοχή του pkb5 απομονώθηκε υπό συνθήκες μετουσίωσης, ήταν απαραίτητο να αναδιπλωθεί αυτή η πρωτεΐνη για περαιτέρω μελέτη.

Στο επόμενο βήμα, τα συγκεντρωμένα κλάσματα υποβλήθηκαν σε διαπίδυση για να αναδιπλωθεί το pkb5 από συνθήκες μετουσίωσης σε φυσικές συνθήκες.

Στο επόμενο στάδιο, για να ελεγχθούν οι βέλτιστες συνθήκες για χρωματογραφικό καθαρισμό του pkb5 διαφόρων κλασμάτων, πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός πρωτεϊνών σε μετουσιωτική γέλη SDS-πολυακρυλαμιδίου.

Ρύζι. Ηλεκτροφερόγραμμα που ελήφθη ως αποτέλεσμα καθαρισμού του pkb5. α) 1- προϊόν λύσης, 2- κλάσματα 13-20, 3- κλάσματα 26-27, 4- κλάσμα 31, 5- δείγμα δοκιμής μετά την αιμοκάθαρση, 6- πρωτεΐνες-δείκτες (Δείκτης Μοριακού Βάρους Προετοιμασμένης Πρωτεΐνης, 20-120 kDa). β) 1- προϊόν λύσης, 2- κλάσματα 13-20, 3- κλάσματα 26-27, 4- κλάσμα 31, 5- πρωτεΐνες-δείκτες (Προϊόντος δείκτης πρωτεΐνης, ευρεία περιοχή, 7-175 kDa), 6- δείγμα δοκιμής μετά την αιμοκάθαρση

Ο πίνακας (..) δείχνει την τελική ποσότητα πρωτεϊνών που εφαρμόζεται στην ηλεκτροφόρηση.

Τραπέζι(..)

Στο επόμενο στάδιο μετά τη σταδιακή αιμοκάθαρση, η συγκέντρωση της μελετημένης πρωτεΐνης pkb 5 αυξήθηκε για περαιτέρω μέτρηση της δραστικότητας.

Η δραστικότητα φωσφοτρανσφεράσης της καταλυτικής περιοχής του pkb5 δοκιμάστηκε προηγουμένως. Υπάλληλοι του εργαστηρίου γενετικής μικροοργανισμών ανώτερος ερευνητής, Ph.D. Mavletova D. A. και κατώτερη ερευνήτρια Mironcheva T. A. IOGen im. Το N.I. Vavilova RAS πραγματοποίησε αυτοφωσφορυλίωση της καταλυτικής περιοχής του pkb5 χρησιμοποιώντας [γ-32Ρ]-ΑΤΡ (Σχήμα).

ΕΝΑ) σι)

Ρύζι. α) Ηλεκτροφερόγραμμα αυτοφωσφορυλίωσης pkb5. β) Αυτοραδιογράφημα αυτοφωσφορυλίωσης pkb5

Έλεγχος δραστηριότητας

Το αντιδραστήριο Kinase-Glo χρησιμοποιεί την υπολειπόμενη ποσότητα ATP ως υπόστρωμα για την Ultra-Glo TM Luciferase, καταλύοντας τη μονοοξυγόνωση της λουσιφερίνης για την παραγωγή ενός φωτονίου φωτός (Εικόνα 1). Η δραστηριότητα της πρωτεϊνικής κινάσης είναι αντιστρόφως ανάλογη με την ένταση του σήματος φωταύγειας.

Ρύζι. 1. Σχέδιο αντίδρασης Kinase-Glo® Assey

Με βάση τα δεδομένα φωταύγειας, κατασκευάστηκε ένα γράφημα της εξάρτησης του ποσοστού αυτοφωσφορυλίωσης από την ποσότητα της πρωτεϊνικής κινάσης pkb 5 ( ρύζι.).

Ρύζι. Ποσοστό αυτοφωσφορυλίωσης pkb 5

Κάτοχοι του διπλώματος ευρεσιτεχνίας RU 2303061:

Η εφεύρεση σχετίζεται με τη βιοτεχνολογία και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την καλλιέργεια βακτηρίων Pseudomonas. Το θρεπτικό μέσο περιέχει ως πηγή αμινοξέων το προϊόν αυτολύσεως εξαντλημένης μαγιάς 7-8ης γενιάς, K 2 HPO 4, MgSO 4 × 7H 2 O και νερό βρύσης. Η εφεύρεση επιτρέπει την αύξηση της απόδοσης βιομάζας βακτηρίων του γένους Pseudomonas. 2 τραπέζια

Το θρεπτικό μέσο μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη βιοτεχνολογία για την καλλιέργεια βακτηρίων του γένους Pseudomonas προκειμένου να ληφθούν βιολογικά προϊόντα με βάση αυτούς τους μικροοργανισμούς που έχουν ανταγωνιστική δράση έναντι μυκητιακών φυτοπαθογόνων.

Υπάρχουν γνωστά στελέχη βακτηρίων του γένους Pseudomonas που έχουν ανταγωνιστική δράση έναντι μυκητιακών φυτοπαθογόνων και χρησιμοποιούνται για τη λήψη φαρμάκων κατά των ασθενειών του σίτου που προκαλούνται από μυκητιακά φυτοπαθογόνα.

Είναι γνωστό το θρεπτικό μέσο LB, το οποίο είναι ένα από τα κύρια για την καλλιέργεια βακτηρίων του γένους Pseudomonas - παραγωγών ουσιών με μυκητοκτόνο δράση και που αποτελείται, g/l:

Πεπτόνη - 10

Εκχύλισμα μαγιάς - 5

Χλωριούχο νάτριο - 10

Νερό βρύσης έως 1 λίτρο.

Το μειονέκτημα του θρεπτικού μέσου είναι το υψηλό του κόστος, καθώς περιέχει ένα τόσο ακριβό συστατικό όπως η πεπτόνη (περίπου 700 ρούβλια/κιλό).

Το γνωστό θρεπτικό μέσο King B, που υιοθετήθηκε ως πρωτότυπο, χρησιμοποιείται επίσης για την καλλιέργεια βακτηρίων του γένους Pseudomonas. Περιλαμβάνει πεπτόνη, γλυκερίνη, διάφορα μεταλλικά άλατα, g/l:

Πεπτόνη - 20

Γλυκερίνη - 10

K 2 HPO 4 - 1,5

MgS04 7H2O - 1,5

Αποσταγμένο νερό έως 1 λίτρο.

Το μειονέκτημά του είναι επίσης το υψηλό κόστος που σχετίζεται με την παρουσία στη σύνθεσή του ενός τόσο ακριβού συστατικού όπως η πεπτόνη.

Στη βιομηχανική παραγωγή βιολογικών προϊόντων που βασίζονται σε βακτήρια του γένους Pseudomonas, που προορίζονται για χρήση στην καλλιέργεια φυτών, το υψηλό κόστος του θρεπτικού μέσου θα οδηγήσει αναπόφευκτα σε αύξηση της τιμής του προϊόντος-στόχου.

Ο τεχνικός στόχος της προτεινόμενης εφεύρεσης είναι η μείωση του κόστους του θρεπτικού μέσου για την καλλιέργεια βακτηρίων του γένους Pseudomonas και η αύξηση της απόδοσης βιομάζας.

Το δηλωμένο τεχνικό καθήκον της μείωσης του κόστους ενός θρεπτικού μέσου για την καλλιέργεια βακτηρίων του γένους Pseudomonas και της αύξησης της απόδοσης βιομάζας επιλύεται χρησιμοποιώντας ένα θρεπτικό μέσο της ακόλουθης σύνθεσης, g/l:

Αυτόματο υλικό εξαντλημένης μαγιάς μπύρας 7-8 γενεών (ξηρά ουσία) - 26,8

K 2 HPO 4 - 1,5

MgS04 7H2O - 1,5

Νερό βρύσης έως 1 λίτρο.

Η χρησιμοποιημένη μαγιά μπύρας της 7ης-8ης γενιάς δεν χρησιμοποιείται στην παραγωγή μπύρας, καθώς τα κύτταρα αυτής της μαγιάς δεν είναι πλέον σε θέση να εκτελούν την κύρια λειτουργία τους κατά τη διαδικασία ζύμωσης. χάνουν επίσης την ικανότητά τους να αναπαραχθούν. Ο αριθμός των νεκρών κυττάρων σε μια τέτοια γενιά φτάνει το 89%, με ασθενή ζωτική δραστηριότητα - έως και 10%. Επί του παρόντος, η χρησιμοποιημένη μαγιά μπύρας δεν βρίσκει κατάλληλη χρήση και, κατά κανόνα, απορρίπτεται στον υπόνομο. Ταυτόχρονα, η αναλωμένη μαγιά μπύρας περιέχει σημαντικές ποσότητες βιταμινών Β, ΡΡ και Ε, καθώς και όλα τα απαραίτητα αμινοξέα.

Οι μικροβιακές καλλιέργειες κατά την καλλιέργειά τους είναι ιδιαίτερα ευαίσθητες στη σύνθεση του θρεπτικού μέσου. Με την επιτυχή επιλογή όλων των συστατικών όσον αφορά την ποιοτική και ποσοτική σύνθεση, ιδιαίτερα το σύνολο των αμινοξέων, το μέσο εξασφαλίζει αρκετά γρήγορη ανάπτυξη και ανάπτυξη του πληθυσμού των μικροοργανισμών και θεωρείται ισορροπημένο. Στην κυτταρική πρωτεΐνη, τα μεμονωμένα αμινοξέα αντιπροσωπεύουν το 1-5% της συνολικής πρωτεΐνης, από την οποία μπορεί να εκτιμηθεί χονδρικά η ποσότητα των αμινοξέων που απαιτούνται ως αυξητικοί παράγοντες. Εξαίρεση αποτελούν το γλουταμικό οξύ και η γλουταμίνη, τα οποία ποσοτικά παίζουν μεγάλο ρόλο στο μεταβολισμό των αμινοξέων και η περιεκτικότητα των οποίων στο μέσο πρέπει να υπερβαίνει σημαντικά την περιεκτικότητα άλλων αμινοξέων. Ο Πίνακας 1 δείχνει τη σύνθεση αμινοξέων που προσδιορίζεται από εμάς της χρησιμοποιημένης μαγιάς μπύρας από διάφορους κατασκευαστές μπύρας, καθώς και ένα δείγμα εμπορικής πεπτόνης που προορίζεται για χρήση σε ορισμένα θρεπτικά μέσα στη μικροβιολογία.

Όπως προκύπτει από τα δεδομένα στον Πίνακα 1, η χρησιμοποιημένη μαγιά μπύρας περιέχει γλουταμικό οξύ σε σημαντική ποσότητα και η περιεκτικότητά της σε ποσοστιαίες τιμές είναι υψηλότερη από ό,τι στην πεπτόνη. Θα πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι η περιεκτικότητα σε όλα τα απαραίτητα αμινοξέα είναι υψηλότερη από αυτή της πεπτόνης, γεγονός που υποδηλώνει μια πιο ισορροπημένη σύνθεση αμινοξέων του προτεινόμενου συστατικού του θρεπτικού μέσου.

Το προτεινόμενο θρεπτικό μέσο παρασκευάζεται ως εξής.

Για να ληφθεί το προϊόν αυτόλυσης, η χρησιμοποιημένη μαγιά μπύρας 7ης-8ης γενιάς υποβάλλεται σε θερμική επεξεργασία στους 100°C για μία ώρα.

Στο προϊόν αυτόλυσης μαγιάς προστίθενται ανόργανα συστατικά, ο όγκος του προκύπτοντος μείγματος ρυθμίζεται στο 1 λίτρο με νερό βρύσης και αποστειρώνεται σε αυτόκλειστο. Προστίθεται εμβόλιο (40 ml βακτηριακής καλλιέργειας Pseudomonas). Το στέλεχος αναπτύσσεται για 48 ώρες στους 28-30°C με σταθερό αερισμό. Στη συνέχεια, ο τίτλος στο υγρό καλλιέργειας προσδιορίζεται με μια γνωστή μέθοδο αραίωσης.

Παράδειγμα 1. Παρασκευάζεται ένα θρεπτικό μέσο της ακόλουθης σύνθεσης. Σε 26,8 g αυτολύματος ζυμομύκητα προσθέστε 1,5 g K 2 HPO 4 και 1,5 g MgSO 4 · 7H 2 O, φέρτε τον όγκο του προκύπτοντος μείγματος στο 1 λίτρο με νερό βρύσης και βάλτε σε αυτόκλειστο. Στη συνέχεια, 40 ml της βακτηριακής καλλιέργειας Pseudomonas aureofaciens IB 51 εμβολιάζονται στο θρεπτικό μέσο. Η ζύμωση πραγματοποιείται για 48 ώρες στους 28-30°C με σταθερό αερισμό. Ο τίτλος του υγρού καλλιέργειας στο τέλος της ζύμωσης είναι 5·10 11 CFU/ml.

Κάτω από παρόμοιες συνθήκες, το στέλεχος IB 51 Pseudomonas aureofaciens καλλιεργείται στο γνωστό μέσο King V. Ο αριθμός των μικροοργανισμών στο τέλος της διαδικασίας καλλιέργειας ήταν 3·10 10 CFU/ml.

Παράδειγμα 2. Το θρεπτικό μέσο παρασκευάζεται όπως περιγράφεται παραπάνω σύμφωνα με το παράδειγμα 1 και 40 ml καλλιέργειας Pseudomonas putida ΙΒ 17 εμβολιάζονται. Η ζύμωση διεξάγεται με παρόμοιο τρόπο σύμφωνα με το παράδειγμα 1. Ο τίτλος του υγρού καλλιέργειας στο τέλος της ζύμωσης είναι 5·1011 CFU/ml.

Κάτω από παρόμοιες συνθήκες, το στέλεχος Pseudomonas putida IB 17 καλλιεργείται στο γνωστό μέσο King V. Ο αριθμός των μικροοργανισμών στο τέλος της διαδικασίας καλλιέργειας ήταν 6·10 10 CFU/ml.

Ο Πίνακας 2 δείχνει τα αποτελέσματα της καλλιέργειας βακτηρίων του γένους Pseudomonas στο μέσο King B (σύμφωνα με το πρωτότυπο) και το προτεινόμενο μέσο. Όπως φαίνεται, ο υψηλότερος τίτλος βακτηρίων του γένους Pseudomonas διατηρείται σε δείγματα όπου το θρεπτικό υλικό περιέχει, αντί για πεπτόνη και γλυκερίνη, το προϊόν αυτολύσεως της χρησιμοποιημένης μαγιάς μπύρας 7ης-8ης γενιάς.

Παράδειγμα 3. Δοκιμή της διατήρησης της ανταγωνιστικής δραστικότητας του στελέχους ΙΒ 51 Pseudomonas aureofaciens που αναπτύχθηκε στο προτεινόμενο μέσο.

Ένα εναιώρημα σπορίων μυκητιακών φυτοπαθογόνων ( Bipolaris sorokiniana). Στη συνέχεια, βακτήρια του στελέχους IB 51 Pseudomonas aureofaciens, που αναπτύχθηκαν στο προτεινόμενο μέσο, ​​φυτεύονται με ένεση στις ίδιες πλάκες. Τα πιάτα επωάζονται στους 28°C για 3 ημέρες.

Ο υπολογισμός της ανταγωνιστικής δραστηριότητας πραγματοποιείται από τη μέση διάμετρο της ζώνης απουσίας ή καταστολής της ανάπτυξης του δοκιμαστικού μύκητα γύρω από την αποικία του στελέχους. Για το Bipolaris sorokiniana ήταν 55 χλστ.

Υπό παρόμοιες συνθήκες, λαμβάνεται υπόψη η ανταγωνιστική δραστηριότητα του στελέχους IB 51 Pseudomonas aureofaciens, που καλλιεργείται στο γνωστό μέσο King V. Η μέση διάμετρος της ζώνης καταστολής της ανάπτυξης των μυκήτων ήταν 55 mm.

Παράδειγμα 4. Ο έλεγχος της διατήρησης και η συνεκτίμηση της ανταγωνιστικής δραστηριότητας του στελέχους IB 17 Pseudomonas putida, που αναπτύχθηκε στο προτεινόμενο μέσο, ​​πραγματοποιείται με τον τρόπο που περιγράφεται παραπάνω σύμφωνα με το παράδειγμα 3. Η μέση διάμετρος της ζώνης καταστολής του ανάπτυξη του μύκητα δοκιμής ήταν 22 mm.

Υπό παρόμοιες συνθήκες, λαμβάνεται υπόψη η ανταγωνιστική δράση του στελέχους IB 17 Pseudomonas putida, που καλλιεργείται στο γνωστό μέσο King V. Η μέση διάμετρος της ζώνης καταστολής της ανάπτυξης των μυκήτων ήταν 22 mm.

Τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 2 και υποδεικνύουν τη διατήρηση της ανταγωνιστικής επίδρασης στελεχών βακτηρίων του γένους Pseudomonas που αναπτύχθηκαν στο προτεινόμενο μέσο στη δοκιμαστική καλλιέργεια του φυτοπαθογόνου μύκητα Bipolaris sorokiniana.

Έτσι, η χρήση του προτεινόμενου θρεπτικού μέσου που περιέχει αυτόλυμα χρησιμοποιημένης μαγιάς μπύρας 7ης-8ης γενιάς ως πηγή αμινοξέων για την καλλιέργεια βακτηρίων του γένους Pseudomonas, που έχουν ανταγωνιστική δράση έναντι μυκητιακών φυτοπαθογόνων, μπορεί να μειώσει σημαντικά το κόστος. βιολογικών προϊόντων που βασίζονται σε αυτούς τους μικροοργανισμούς και αυξάνουν την απόδοση της βιομάζας.

Βιβλιογραφία

1. RF δίπλωμα ευρεσιτεχνίας 2203945, 7 С12N 1/20, А01N 63/00 // (С12N 1/20, С12R 1:38). Ένα στέλεχος βακτηρίων Pseudomonas aureofaciens για τη λήψη ενός φαρμάκου κατά των ασθενειών του σίτου που προκαλούνται από μυκητιακά φυτοπαθογόνα. / Loginov O.N., Sveshnikova E.V., Silishchev N.N., Melentyev A.I., Galimzyanova N.F., Boyko T.F.; δηλώθηκε 17/08/2001; δημοσίευση 05/10/2003. Δελτίο 13.

2. RF δίπλωμα ευρεσιτεχνίας 2213774, 7 С12N 1/20 // (С12N 1/20, С12R 1:40). Ένα στέλεχος βακτηρίων Pseudomonas putida για τη λήψη ενός φαρμάκου κατά των ασθενειών του σίτου που προκαλούνται από μυκητιακά φυτοπαθογόνα. / Loginov O.N., Sveshnikova E.V., Silishchev N.N., Melentyev A.I., Galimzyanova N.F., Boyko T.F., Isaev R.F.; δηλώθηκε 25/03/2002; δημοσίευση 10.10.2003. Δελτίο 28.

3. RF πατέντα 2130265, 6 A01N 63/00 // (A01C 1/00). Μια μέθοδος καταπολέμησης των παθογόνων φυτών. / Dashkevich V.S., Dashkevich N.Yu., Ashmarina L.F., Shusharo A.I., δηλ. 29/12/97; δημοσίευση 20.05.99. Δελτίο 14.

4. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. Δύο απλά μέσα για την επίδειξη της πυοκυανίνης και της φλουορεσκίνης. //J.Lab. Clin. Med. - 1954. - V.44. - Σελ.301-307.

5. Smirnov V.V., Kiprianova E.A. Βακτήρια του γένους Pseudomonas. Kyiv, “Naukova Dumka”, 1990. - Σελ.222.

6. Gurevich Yu.L. Σταθερότητα και ρύθμιση της αναπαραγωγής σε μικροβιακούς πληθυσμούς. - Novosibirsk, Science, 1984. - P.28-29.

7. Manakov M.N., Pobedimsky D.G. Θεωρητικές βάσεις μικροβιολογικής παραγωγής. - M.: Agropromizdat, 1990. - Σ. 180-181.

8. Perth S.J. Βασικά στοιχεία καλλιέργειας μικροοργανισμών και κυττάρων. Μ.: Μιρ, 1978. - σσ. 147-148.

9. Tepper E.Z., Shilnikova V.K., Pereverzeva G.I. Εργαστήριο μικροβιολογίας. - M.: Bustard, 2004. - 256 σελ.

Τραπέζι 1
Σύνθεση αμινοξέων πεπτόνης και αναλωμένης μαγιάς από διάφορες ζυθοποιίες
	Μαγιά αναλωμένη (Ούφα, Εφές)	Αναλωμένη μαγιά (Sterlitamak, Shikhan-Heineken)	Αναλωμένη μαγιά (Novotroitsk, PIT)	πεπτόνη
Θρεονίνη	5,56%	5,45%	5,25%	2,09%
Valin	4,67%	4,34%	5,34%	2,22%
Μεθειονίνη	1,83%	1,85%	2,00%	0,96%
Ισολευκίνη	5,22%	4,50%	5,30%	1,81%
Λευκίνη	6,93%	6,31%	7,03%	2,98%
Τυροσίνη	4,28%	3,72%	4,44%	0,78%
Φαινυλαλανίνη	4,97%	4,86%	5,37%	2,34%
Λυσίνη	11,07%	10,57%	11,71%	4,85%
Κυστίνη	1,24%	1,72%	1,55%	0,23%
Serin	5,35%	5,86%	5,87%	3,50%
Γλουταμινικό οξύ	15,20%	13,70%	13,40%	11,35%
Προλίνη	5,40%	6,23%	4,87%	14,46%
Γλυκίνη	5,78%	5,33%	5,36%	27,33%
Αλανίνη	8,37%	7,42%	7,80%	8,97%
Ιστιδίνη	3,34%	2,00%	3,47%	0,75%
Αργινίνη	0,79%	6,54%	1,09%	9,52%
Ασπαρτικό οξύ	10,00%	9,60%	10,15%	5,86%

Θρεπτικό μέσο για την καλλιέργεια βακτηρίων του γένους Pseudomonas που χρησιμοποιείται για την παραγωγή αντιμυκητιασικών φαρμάκων, που περιέχει πηγή αμινοξέων, K 2 HPO 4, MgSO 4 · 7H 2 O και νερό, που χαρακτηρίζεται από το ότι ως πηγή αμινοξέων περιέχει αυτολύμα χρησιμοποιημένης μαγιάς μπύρας 7-8ης γενιάς και νερό βρύσης με την ακόλουθη αναλογία συστατικών, g/l:

Παρόμοια διπλώματα ευρεσιτεχνίας:

Η εφεύρεση σχετίζεται με την ιατρική, ειδικότερα την επιδημιολογία και τη μικροβιολογία, και μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην επιδημιολογική επιτήρηση πυωδών-σηπτικών λοιμώξεων για την αναγνώριση νοσοκομειακών μικροβιακών συσχετισμών.

Η εφεύρεση αναφέρεται στη βιοτεχνολογία, συγκεκριμένα σε βιολογικά ενεργά σύμπλοκα, παρασκευάσματα για την ιατρική, τη γεωργία και τη βιομηχανία τροφίμων, και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παρασκευή θεραπευτικών και προφυλακτικών παρασκευασμάτων που βασίζονται σε ζωντανά γαλακτοβακτήρια και bifidobacteria.