Razmnožavanje E.coli u hranjivim podlogama i njegovi čimbenici. Hranjiva podloga za uzgoj bakterija roda pseudomonas Gustoća pripremljene podloge

Razmnožavanje E. coli u standardnim uvjetima može se opisati krivuljom, koja predstavlja ovisnost broja stanica E coli u suspenziji od vremena rasta (vidi sliku u prezentaciji). Broj ćelija E coli u suspenziji je ekvivalentna optičkoj gustoći kulture E. coli izmjerenoj na 600 nm („mutnoća suspenzije”). Krivulja reprodukcije E coli uključuje 4 glavne faze: (početna faza, lag-faza), eksponencijalna faza (eksponencijalna, logaritamska faza), stacionarna faza (stacionarna faza) i faza smrti. Tijekom početne faze rasta, povećanje stanične biomase događa se vrlo sporo. To je zbog početno malog broja stanica. Kada optička gustoća suspenzije dosegne približno 0,1, rast E. coli ulazi u eksponencijalnu fazu – fazu brzog rasta. Utvrđeno je da se tijekom eksponencijalne faze optička gustoća kulture udvostručuje u prosjeku svakih 30 minuta. Kada optička gustoća suspenzije postane približno 1,5, zbog velikog broja stanica i male količine hranjivih tvari u mediju, rast E coli značajno usporava i prelazi u stacionarnu fazu. I konačno, pretjerano veliki broj stanica u suspenziji, gotovo potpuno iscrpljivanje hranjivog medija i visoka koncentracija bakterijskih metabolita u njemu dovode do smrti bakterijskih stanica, njihove lize i smanjenja gustoće bakterijske kulture ( faza smrti).

Standardni uvjeti rasta E coli u suspenziji su sljedeći parametri: hranjiva podloga LB-bujon, temperatura 37 °C, intenzivno miješanje (najmanje 150 okretaja u minuti) i dovoljno prozračivanje. Treba napomenuti da rast E coli moguće ne samo u suspenziji, već i na tzv. čvrstim hranjivim podlogama koje sadrže agar. U tom slučaju nije potrebno intenzivno miješanje.

Hranjive podloge za rastE coli .

Tekuće podloge za kulturu. Kao što je gore spomenuto, najčešće korišteni medij za rast je E coli u suspenziji je LB-bujon medij (Luria Bertani medij, lizogeni bujon). Ovaj visoko hranjivi medij, a njegove glavne komponente su tripton ili pepton, ekstrakt kvasca i NaCl. Tripton (pepton) su produkti hidrolize kazeina pod djelovanjem tripsina (pepsina) i služe kao izvori aminokiselina i peptida. Ekstrakt kvasca je izvor ugljika, vitamina (uključujući skupinu B), kao i minerala kao što su ioni magnezija, sumpora i kalcija; a NaCl osigurava bakterijskim stanicama Na + ione za provedbu učinkovitog transporta i održavanje osmotske ravnoteže. Za pripremu LB medija otopite 10 g triptona, 5 g ekstrakta kvasca i 10 g NaCl (ili 25 g gotove mješavine) u 1 litri vode, autoklavirajte i ohladite. Treba napomenuti da je rast raznih sojeva E coli u mediju LB javlja se različitim brzinama i neki sojevi su vrlo osjetljivi na visok sadržaj NaCl. Poznato je da NaCl u koncentraciji od 10% može imati inhibicijski učinak na rast nekih sojeva E. coli. U tom smislu razvijeni su protokoli za LB medij srednjeg udjela soli (5 g NaCl/L LB) i LB medij s niskim udjelom soli (0,5 g NaCl/L) s identičnim sadržajem peptona i ekstrakta kvasca. Verzija LB medija s niskim udjelom soli također se koristi ako se u medij za rast treba dodati antibiotik osjetljiv na visoke koncentracije soli. pH LB medija bez dodatnog podešavanja je približno 7,0 – 7,2.

Normalno, za postizanje stacionarne faze, rasti E coli treba biti 14-18 sati, međutim, ponekad se javljaju situacije kada je potrebno rasti E coli nekoliko dana (na primjer, za proizvodnju velikih količina biomase tijekom ekspresije proteina). U ovom slučaju primjena LB medija nije učinkovita, jer dolazi do iscrpljivanja hranjivih tvari i pada pH medija uzrokovanog visokom koncentracijom metabolita, što inicira smrt stanica i inhibira njihov rast. U takvim slučajevima, za rast E coli koristiti druge medije koji sadrže dodatne hranjive tvari i puferske sustave za održavanje pH. Kako bi povećali hranjive tvari, većina ovih medija sadrži dva ili tri puta veću količinu triptona i ekstrakta kvasca. Osim toga, neki mediji uključuju: glicerol ili glukozu kao dodatne izvore ugljika (TB, SOC mediji), sustav fosfatnog pufera ili CaCO 3, koji sprječavaju zakiseljavanje medija i održavaju njegov pH u stacionarnoj fazi rasta E coli(TB okolina), kao i Mg 2+ i K + soli (2*YT, SOB, SOC okoline).

Za rast E coli Tekući mediji kulture obično koriste prethodno sterilizirane ili alkoholom obrađene stožaste staklene tikvice ili plastične Falcon epruvete od 50 ml. Proširenje biomase E coli za naknadnu izolaciju plazmidne DNA, obično se provodi preko noći, tj. dobiva se kultura "preko noći". Da bi se to postiglo, mala količina bakterija prethodno transformiranih plazmidom stavi se u tikvicu ili plastičnu epruvetu s medijem u prisutnosti potrebnog antibiotika i kultura se uzgaja na 37°C i 150 okretaja u minuti tijekom 14-18 sati. . Gotova kultura “preko noći” je zamućena suspenzija stanica u mediju. Za provedbu nekih zadataka (na primjer, dobivanje kompetentnih stanica ili ekspresija rekombinantnih proteina), potrebno je uzgajati stanice do određenih vrijednosti OD600 (obično 0,3 – 0,8). U takvim slučajevima potrebno je pratiti optičku gustoću rastućeg usjeva kako se ne bi propustio trenutak postizanja željene optičke gustoće.

Čvrste hranjive podloge.Čvrsta hranjiva podloga koristi se kada je potrebno dobiti pojedinačne kolonije E coli. To je obično potrebno kada se stanice transformiraju heterogenom mješavinom plazmidne DNA (na primjer, u slučaju smjese ligaza) i potrebno je pronaći koloniju koja sadrži ispravnu varijantu plazmida. Tipično u slučaju čvrstih medija za rast E coli koristite plastične čaše za jednokratnu upotrebu promjera 90 mm. Najčešći čvrsti medij kulture je 1,5% agar pripremljen na LB (LB agar). Za pripremu 1 litre takvog medija potrebno je 15 g agara, 10 g triptona, 5 g ekstrakta kvasca i 10 g NaCl (ili 25 g pripremljene LB smjese) otopiti u 1 litri destilirane vode i autoklavirati. . Agar ohladiti na temperaturu od 50°C - 60°C, dodati mu potreban antibiotik, uliti u čašice po cca 10 ml po čašici i ostaviti da se stvrdne pod laminatom pored plamenika, s poklopcem. lagano otvoren. Nakon što kondenzacija ispari, čašica se može koristiti za inokulaciju bakterija.

Temperatura. Sa smanjenjem temperature raste E coli usporava, ali u nekim slučajevima E. coli se uzgaja na nižim temperaturama nekoliko dana, primjerice kada se kuha iz kulture E coli kompetentnih stanica ili nakon ekspresije rekombinantnih proteina.

Miješanje i prozračivanje. Kako biste osigurali dovoljno prozračivanja, uzgajajte E coli u suspenziji je potrebno uz intenzivno miješanje (najmanje 150 okretaja u minuti), a posuda (tikvica ili plastična epruveta) mora biti napunjena medijem maksimalno do 1/10 ukupnog volumena. Kako bi se poboljšala aeracija, poklopci epruveta koje se koriste za uzgoj bakterijske kulture labavo se zatvaraju, a za zatvaranje tikvica koristi se folija. U nekim slučajevima koriste se tikvice s posebnim unutarnjim oštricama - "odbojnici". Kod miješanja u takvim tikvicama površina kontakta medija i zraka zamjetno se povećava zbog prskanja tekućine. Što je više odbojnika u tikvici, to je jače prskanje tekućine i veća je aeracija. U slučaju rasta E coli na čvrstoj hranjivoj podlozi dolazi do prozračivanja jer je između stijenki bakterijske zdjelice i poklopca predviđen prostor za prodor zraka.

Antibiotici Kao što je gore spomenuto, većina plazmida sadrži gen otpornosti na antibiotike, u čijoj prisutnosti postoji selekcija stanica koje sadrže plazmid od stanica koje ga ne sadrže. Antibiotici koji se najčešće koriste za odabir su ampicilin (radna koncentracija - 100 μg/ml), kanamicin (radna koncentracija - 30 μg/ml) i kloramfenikol (radna koncentracija - 25-30 μg/ml). Antibiotici se obično otapaju u etanolu ili vodi (svaki antibiotik ima svoje uvjete topljivosti), pripremaju se tisućustruke temeljne otopine i čuvaju na -20°C. Prije dodavanja antibiotika u LB agar potrebno ga je ohladiti na 50-60°C jer se antibiotici lako uništavaju na visokim temperaturama. Neki antibiotici, poput ampicilina, osjetljivi su na svjetlost, pa je preporučljivo uzgajati bakterije u njihovoj prisutnosti u mraku.

Ovi mediji se koriste za uzgoj i skladištenje rekombinantnih sojeva Escherichia coli, kao i za uobičajeni uzgoj ne baš izbirljivih mikroorganizama.

Spoj**:

** Sastav je provjeren i prilagođen zadanim parametrima

priprema:

Pomiješajte 35,0 g praha M557 ili 20,0 g praha M575 ili 40,0 g praha M1151 ili 25,0 g praha M1245 u 1000 ml destilirane vode. Zagrijte da se čestice potpuno otope. Sterilizirajte autoklavom na 1,1 atm (121°C) 15 minuta. Ulijte u odgovarajuće posude.

Princip i ocjena rezultata:

Agar i Luria bujon pripremaju se prema Lennox receptu (1) za uzgoj i skladištenje rekombinantnih sojeva Escherichia coli. Preostali medij (2) malo se razlikuje po tome što ima dvostruku koncentraciju natrijevog klorida. Ti mediji sadrže dovoljno hranjivih tvari za rast rekombinantnih sojeva. Takvi sojevi su obično derivati Escherichia coli K12, manjak u sintezi vitamina B. Zbog ovog i drugih markera auksotrofije dobivenih tijekom mutageneze, rekombinantni sojevi mogu izgubiti sposobnost rasta na medijima osiromašenog sastava.

Kazein hidrolizat osigurava prisutnost peptida u mediju, ekstrakt kvasca - vitamine B, natrijev klorid - natrijeve ione za membranski transport i održavanje optimalnog osmotskog tlaka.

Kontrola kvalitete:

Izgled pudera:

Homogeni sipki svijetložuti prah.

Gustoća gotovog medija:

Formira se medij koji po gustoći odgovara 1,5% agar gelu (M557 ili M1151).

Boja i prozirnost gotovog medija:

Medij je žute ili jantarne boje, proziran ili blago opalescentan ako se gel stvara u epruvetama ili Petrijevim zdjelicama.

Kiselost sredine:

Na 25°C, vodene otopine M557 (3,5% w/v) ili M575 (2,0% w/v) imaju pH 7,0 ± 0,2, a vodene otopine M1151 (4,0% w/v) ili M1245 (2,5% w/v) imaju pH 7,5 ± 0,2.

Tema: Izolacija i pročišćavanje proteinapkb5

eksperimentalni dio

Sojevi i mediji.

Soj korišten u ovom radu E. coliB.L.21(DE3) pLysS, s plazmidom pET32a:Pkb5 (slika), koji sadrži katalitičku domenu Bifidobacterium longum protein kinaze pkb5.

Za rast stanica E. coli Korištene su hranjive podloge za LB i TBC.

Tablica 1 - Hranjive podloge korištene za uzgoj E. coli

Medij je steriliziran u autoklavu pri tlaku od 0,8 atm tijekom 40 minuta.

Za održavanje napetosti E. coliB.L.21(DE3) pLysS, koji sadrži plazmid pET32a:Pkb5, provedeno je monoklonsko sijanje na Petrijevim zdjelicama s LB agar medijem uz dodatak kloramfenikola (30 μg/ml) i ampicilina (150 μg/ml).

Za stvaranje stanične biomase E. coliB.L.21(DE3) pLysS, koji sadrže pET32a:Pkb5 plazmid, uzgojeni su u posudama na TV mediju uz dodatak kloramfenikola i ampicilina.

U prvoj fazi uzgajani su noćni usjevi u TV mediju. U drugoj fazi, 1,5 noćne kulture su dodane u tikvice sa 150 ml svježeg medija. Uzgoj je proveden u uvjetima prozračivanja pri 250 rpm i temperaturi od 37 0 C do optičke gustoće OD 600 = 0,6 (~ 2 sata), zatim je ekspresija inducirana dodavanjem IPTG (izopropil - β-D-tiogalaktozid) u konačni koncentracija 0,5 mm. Zatim je provedena kultivacija na 28 0 C tijekom 18 sati, nakon čega je biomasa peletirana centrifugiranjem 10 minuta na 6000 okretaja u minuti, isprana s 1M Tris-HCl (pH 7,6-8,0) i zamrznuta na -20 0C.

Riža. Shema izgradnje plazmida pET32a: Pkb5 .

Priprema lizataE .S oli

Odmrznute stanice E.Soli na temperaturi od 4°C. Otopljene stanice su isprane iz medija za rast s 20 volumena (18 ml) 1 M Tris-HCl, pH 7,8. Stanice su taložene centrifugiranjem na 7500 okretaja u minuti tijekom 10 minuta na temperaturi od 4°C. Masa sedimenta je određena na 1,61 g na analitičkoj vagi. Sedimenti su resuspendirani u 10 volumena pufera za lizu koji sadrži 300 mM KCl. , 50 mM KH2PO4, 5 mM imidazola, 6 M koktel inhibitora uree (potpuno bez EDTA, Roche Diagnostics Gmbh, Njemačka). Stanice su lizirane pomoću ultrazvučnog dezintegratora SONICS VIBRA CELL 3 puta po 59 sekundi s intervalom od 15 sekundi pri amplitudi od 40% i temperaturi od 4 0 C. Da bi se taložili fragmenti stanične stijenke, lizat je centrifugiran na 10 000 okretaja u minuti tijekom 20 minuta na temperaturi od 4°C. Supernatant je sakupljen i filtriran kroz filter (promjer pora 0,22 µm, Merck Millipore Ltd, Njemačka) neposredno prije nanošenja na kolonu.

Metalna afinitetna kromatografija

Metoda metalne afinitetne kromatografije temelji se na nekovalentnoj interakciji 6 histidinskog fragmenta rekombinantnog proteina (His-Tag) s ionima nikla (Ni 2+), tvoreći koordinacijske veze s ostacima nitrooctene kiseline.

Pročišćavanje je provedeno na Bio Logic LP Model 2110 Fraction Collector (Bio Rad, SAD) korištenjem kolone Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges od 1 ml.

Pročišćavanje proteina provedeno je prema priručniku za metodu Profinite IMAC Resins (Bio Rad, SAD).

Prije početka rada sustav je ispran destiliranom vodom, ugrađena je kolona Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges te je kolona isprana destiliranom vodom brzinom od 2 ml/min. Kolona je uravnotežena s 8 volumena pufera za lizu brzinom od 2 ml/min, lizat je primijenjen u volumenu od 15 ml brzinom od 0,5 ml/min, isprana s 15 volumena pufera za lizu brzinom od 2 ml /min, zatim ispran s 15-3 volumena pufera za ispiranje brzinom od 2 ml/min, elucija je provedena s 15 volumena pufera za ispiranje brzinom od 2 ml/min. Frakcije su sakupljene u volumenima od 2 ml. Frakcije koje odgovaraju eluiranom proteinu sakupljene su odvojeno.

Na kraju rada kolona je isprana s 2 ml destilirane vode brzinom od 2 ml/min i regenerirana s 5 volumena 6 M gvanidin-HCl i potom destiliranom vodom. Korištena kolona pohranjena je u 20% etanolu na 4°C.

Sastav puferske otopine

Određivanje količine proteina

Količine proteina određene su Bradfordovom metodom (Bradford M.M., 1976.).

Digitalnim spektrofotometrom PD-303 određena je optička gustoća na valnoj duljini od 595 nm za frakcije 31 i 32 te je iz grafikona (sl.) određena količina proteina i izračunata koncentracija.

Sastav boje: 100 mg CBB (Coomassie Brilliant Blue G-250), 95% C 2 H 5 OH, 85% H 3 PO 4

Riža. Grafikon za određivanje količine ispitnog uzorka Breedfordovom metodom

Postupna dijaliza

Cijevi za dijalizu korištene u radu bile su SnakeSkin Pleated Dialysis Tubing (Thermo science), promjer pora 3500 MVCO.

Odabrane frakcije dijalizirane su protiv puferske otopine koja sadrži 50 mM Tris-HCl, 5 mM β-merkaptoetanola, 10% glicerola, 3 M uree na temperaturi od 4°C tijekom 2,5 sata uz stalno miješanje. Zatim je pufer za dijalizu zamijenjen puferom za dijalizu koji je sadržavao 50 mM Tris-HCl, 5 mM β-merkaptoetanola, 10% glicerola, 1,5 M uree, 2 mM MgCl2. Ostaviti preko noći uz stalno miješanje na 4 0 C.

Elektroforetsko odvajanje proteina u denaturirajućem SDS-poliakrilamidnom gelu

Elektroforeza je provedena prema Laemmli metodi (Laemmli U. K., 1970.) korištenjem Mini proteam sistema. 12% poliakrilamidni gel u puferu koji je sadržavao 0,375 M Tris-HCl pH 8,8, 0,1% SDS korišten je kao radni gel; 3% poliakrilamidni gel koji je sadržavao 0,125 M Tris-HCl pH 6,8 korišten je kao gel za formiranje 0,1% SDS .

Pufer elektrode bio je 0,025 M Tris, 0,192 M glicin, 0,1% SDS.

Prije aplikacije uzorci su zagrijavani u puferu koji je sadržavao 0,0625 M Tris-HCl pH 6,8, 2,3% SDS, 5% β-merkaptoetanola, 10% glicerola i 0,001% brom fenol plavog. Elektroforeza je provedena pri konstantnom naponu od 200 volti. Na kraju elektroforeze, PAGE je fiksiran 30 minuta u otopini koja sadrži 50% C2H5OH i 10% CH3COOH. Zatim je izvršeno bojanje u otopini koja sadrži 0,2% SBB g-250, 40% C2H5OH, 8% CH3COOH uz zagrijavanje. PAGE je ispran u 7% CH3COOH.

Koncentracija

Za daljnje mjerenje aktivnosti pkb 5 katalitičke domene, eluirani protein je koncentriran pomoću Amicon Ultra Centrifugalnih Filtera, promjera pora 50,000 NMWL (Merck Millipore Ltd).

Uzorak proteina koncentriran je pomoću Eppendorf 5430 R centrifugiranja na 7500 okretaja u minuti tijekom 1 sata i 20 minuta na temperaturi od 4°C.

Provjera aktivnosti

Određivanje autofosforilacije pkb 5 (rekombinantnog proteina) provedeno je korištenjem Kinase-Glor Plus Luminiscent Kinase Assey (Promega V3772), korištenog za mjerenje opsega fosforilacije razinom ATP-a preostalog tijekom reakcije.

Koristeći automatiziranu radnu stanicu Biomek 3000 Beckman Coulter©, 15 μl otopine pkb 5 (5 μg i 1 μg u reakcijskoj smjesi) u reakcijskom puferu (15 mM HEPES pH 7,4; 20 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 0,5 mM EDTA, 0,02% Tween-20, 10 mg/ml BSA) i 15 μl reakcijskog pufera (kontrola bez protein kinaze).

U svaku jažicu dodano je 20 μM ATP (15 μl) i sadržaj jažica je promiješan. Inkubirajte na sobnoj temperaturi 30 minuta, pokrivajući ploču poklopcem kako biste spriječili isparavanje.

Na kraju enzimske reakcije u svaku jažicu dodano je 30 μl reagensa za određivanje luminiscencije, ploča je inkubirana 40 minuta na sobnoj temperaturi, a luminiscencija je mjerena na Beckman Coulter© DTX 880 Multimode Detector.

Rasprava o rezultatima

U fazi kromatografije s afinitetom prema metalu, iz kromatograma je utvrđeno da se proučavani protein pkb 5 nalazi u frakcijama 31 i 32.

Slika. Kromatogram izolacije pkb 5 katalitičke domene

Frakcije 31 i 32 su spojene jer su sadržavale protein koji se proučava.

Budući da je katalitička domena pkb5 izolirana u uvjetima denaturacije, bilo je potrebno ponovno smotati ovaj protein za daljnje proučavanje.

U sljedećem koraku, skupljene frakcije su dijalizirane kako bi se pkb5 ponovno smotao iz denaturirajućih uvjeta u prirodne uvjete.

U sljedećoj fazi, kako bi se provjerili optimalni uvjeti za kromatografsko pročišćavanje pkb5 različitih frakcija, provedeno je elektroforetsko odvajanje proteina u denaturirajućem SDS-poliakrilamidnom gelu.

Riža. Elektroferogram dobiven kao rezultat pročišćavanja pkb5; a) 1- lizat, 2- frakcije 13-20, 3- frakcije 26-27, 4- frakcija 31, 5- testni uzorak nakon dijalize, 6- markerski proteini (prebojirani proteinski marker molekularne mase, 20-120 kDa); b) 1- lizat, 2- frakcije 13-20, 3- frakcije 26-27, 4- frakcija 31, 5- marker proteini (Prestained Protein Marker, Broad Range, 7-175 kDa), 6- testni uzorak nakon dijalize

Tablica (..) pokazuje konačnu količinu proteina primijenjenih na elektroforezu.

Stol(..)

U sljedećoj fazi nakon postupne dijalize povećana je koncentracija proučavanog proteina pkb 5 za daljnje mjerenje aktivnosti.

Prethodno je ispitana aktivnost fosfotransferaze katalitičke domene pkb5. Djelatnici Laboratorija za genetiku mikroorganizama znanstveni savjetnik dr. sc. Mavletova D. A. i znanstveni novak Mirončeva T. A. IOGen im. N.I. Vavilova RAS provela je autofosforilaciju katalitičke domene pkb5 pomoću [γ-32P]-ATP (Sl.).

A) b)

Riža. a) Elektroferogram pkb5 autofosforilacije. b) Autoradiogram pkb5 autofosforilacije

Provjera aktivnosti

Kinase-Glo reagens koristi zaostalu količinu ATP-a kao supstrat za Ultra-Glo TM luciferazu, katalizirajući monooksigenaciju luciferina za proizvodnju fotona svjetlosti (Slika 1). Aktivnost protein kinaze obrnuto je proporcionalna intenzitetu signala luminescencije.

Riža. 1. Kinase-Glo® Assey Reakcijska shema

Na temelju luminescentnih podataka konstruiran je grafikon ovisnosti postotka autofosforilacije o količini protein kinaze pkb 5 ( riža.).

Riža. Postotak autofosforilacije pkb 5

Vlasnici patenta RU 2303061:

Izum se odnosi na biotehnologiju i može se koristiti za uzgoj bakterije Pseudomonas. Hranjivi medij kao izvor aminokiselina sadrži autolizat istrošenog kvasca 7-8. generacije, K 2 HPO 4, MgSO 4 × 7H 2 O i vodu iz slavine. Izum omogućuje povećanje prinosa biomase bakterija iz roda Pseudomonas. 2 stola

Hranjivi medij se može koristiti u biotehnologiji za uzgoj bakterija roda Pseudomonas u svrhu dobivanja bioloških proizvoda na bazi ovih mikroorganizama koji imaju antagonističko djelovanje prema gljivičnim fitopatogenima.

Poznati su sojevi bakterija iz roda Pseudomonas koji imaju antagonističko djelovanje prema gljivičnim fitopatogenima i koriste se za dobivanje lijekova protiv bolesti pšenice uzrokovanih gljivičnim fitopatogenima.

Poznat je hranjivi medij LB, koji je jedan od glavnih za uzgoj bakterija roda Pseudomonas - proizvođača tvari s fungicidnim djelovanjem i koji se sastoji, g/l:

Pepton - 10

Ekstrakt kvasca - 5

Natrijev klorid - 10

Voda iz slavine do 1 litre.

Nedostatak hranjivog medija je njegova visoka cijena, budući da sadrži tako skupu komponentu kao što je pepton (oko 700 rubalja / kg).

Poznati hranjivi medij King B, usvojen kao prototip, također se koristi za uzgoj bakterija iz roda Pseudomonas. Sadrži pepton, glicerin, razne mineralne soli, g/l:

Pepton - 20

Glicerin - 10

K 2 HPO 4 - 1,5

MgS047H20 - 1,5

Destilirana voda do 1 litre.

Njegov nedostatak je također visoka cijena povezana s prisutnošću u svom sastavu tako skupog sastojka kao što je pepton.

U industrijskoj proizvodnji bioloških pripravaka na bazi bakterija roda Pseudomonas, namijenjenih uporabi u uzgoju biljaka, visoka cijena hranjivog medija neizbježno će dovesti do povećanja cijene ciljanog proizvoda.

Tehnički cilj predloženog izuma je smanjenje troškova hranjivog medija za uzgoj bakterija roda Pseudomonas i povećanje prinosa biomase.

Navedeni tehnički zadatak smanjenja troškova hranjive podloge za uzgoj bakterija roda Pseudomonas i povećanja prinosa biomase rješava se korištenjem hranjive podloge sljedećeg sastava, g/l:

Autolizat istrošenog pivskog kvasca 7-8 generacija (suha tvar) - 26,8

K 2 HPO 4 - 1,5

MgS047H20 - 1,5

Voda iz slavine do 1 litre.

Istrošeni pivski kvasac 7.-8. generacije ne koristi se u proizvodnji piva, budući da stanice takvog kvasca više nisu sposobne obavljati svoju glavnu funkciju tijekom procesa fermentacije; gube i sposobnost reprodukcije. Broj mrtvih stanica u takvoj generaciji doseže 89%, uz slabu vitalnu aktivnost - do 10%. Trenutno istrošeni pivski kvasac ne nalazi kvalificiranu upotrebu i, u pravilu, ispušta se u kanalizaciju. Istodobno, istrošeni pivski kvasac sadrži značajne količine vitamina B, PP i E, kao i sve esencijalne aminokiseline.

Mikrobne kulture tijekom uzgoja vrlo su osjetljive na sastav hranjivog medija. Uspješnim odabirom svih komponenti u pogledu kvalitativnog i kvantitativnog sastava, posebice skupa aminokiselina, podloga osigurava prilično brz rast i razvoj populacije mikroorganizama i smatra se uravnoteženom. U staničnom proteinu, pojedinačne aminokiseline čine 1-5% ukupnog proteina, iz čega se može grubo procijeniti količina aminokiselina potrebnih kao faktora rasta. Izuzetak su glutaminska kiselina i glutamin, koji kvantitativno imaju veliku ulogu u metabolizmu aminokiselina i čiji bi sadržaj u mediju trebao biti značajno veći od sadržaja ostalih aminokiselina. Tablica 1. prikazuje aminokiselinski sastav koji smo mi odredili istrošenog pivskog kvasca raznih proizvođača piva, kao i uzorak komercijalnog peptona namijenjenog upotrebi u nekim hranjivim podlogama u mikrobiologiji.

Kao što proizlazi iz podataka u tablici 1. istrošeni pivski kvasac sadrži glutaminsku kiselinu u značajnoj količini, a njen sadržaj u postocima veći je nego u peptonu. Također treba napomenuti da je sadržaj svih esencijalnih aminokiselina veći od sadržaja peptona, što ukazuje na uravnoteženiji sastav aminokiselina predložene komponente hranjivog medija.

Predloženi hranjivi medij se priprema na sljedeći način.

Za dobivanje autolizata, istrošeni pivski kvasac 7.-8. generacije podvrgava se toplinskoj obradi na 100°C tijekom jednog sata.

Mineralne komponente se dodaju u autolizat kvasca, volumen dobivene smjese se podesi na 1 litru vodom iz slavine i autoklavira. Doda se inokulum (40 ml kulture bakterija Pseudomonas). Soj se uzgaja 48 sati na 28-30°C uz stalno prozračivanje. Zatim se titar u tekućini kulture odredi poznatom metodom razrjeđivanja.

Primjer 1. Priprema se hranjivi medij sljedećeg sastava. U 26,8 g autolizata kvasca dodajte 1,5 g K 2 HPO 4 i 1,5 g MgSO 4 · 7H 2 O, dovedite volumen dobivene smjese na 1 litru vodom iz slavine i autoklavirajte. Zatim se u hranjivu podlogu inokulira 40 ml bakterijske kulture Pseudomonas aureofaciens IB 51. Fermentacija se provodi 48 sati na 28-30°C uz stalno prozračivanje. Titar tekućine kulture na kraju fermentacije je 5·10 11 CFU/ml.

Pod sličnim uvjetima, Pseudomonas aureofaciens soj IB 51 kultiviran je na dobro poznatom mediju King V. Broj mikroorganizama na kraju procesa uzgoja bio je 3·10 10 CFU/ml.

Primjer 2. Hranjivi medij je pripremljen kako je gore opisano prema primjeru 1 i inokulirano je 40 ml kulture Pseudomonas putida IB 17. Fermentacija se provodi na sličan način kao u primjeru 1. Titar tekućine kulture na kraju fermentacije je 5,10 11 CFU/ml.

U sličnim uvjetima, soj Pseudomonas putida IB 17 je kultiviran na poznatom mediju King V na kraju procesa kultivacije bio je 6·10 10 CFU/ml.

U tablici 2 prikazani su rezultati uzgoja bakterija roda Pseudomonas na podlozi King B (prema prototipu) i predloženoj podlozi. Kao što se vidi, najveći titar bakterija roda Pseudomonas održavaju uzorci u kojima je hranjiva podloga umjesto peptona i glicerola sadržavala autolizat istrošenog pivskog kvasca 7.-8.generacije.

Primjer 3. Ispitivanje očuvanja antagonističke aktivnosti soja Pseudomonas aureofaciens IB 51 uzgojenog na predloženom mediju.

Suspenzija spora gljivičnih fitopatogena (Bipolaris sorokiniana). Zatim se na iste pločice injekcijom posadi bakterija Pseudomonas aureofaciens soj IB 51, uzgojena na predloženoj podlozi. Posude se inkubiraju na 28°C 3 dana.

Računanje antagonističke aktivnosti provodi se prosječnim promjerom zone odsutnosti ili supresije rasta ispitivane gljive oko kolonije soja. Za Bipolaris sorokiniana iznosio je 55 mm.

U sličnim uvjetima uzima se u obzir antagonistička aktivnost soja Pseudomonas aureofaciens IB 51, uzgojenog na dobro poznatoj podlozi King V. Prosječni promjer zone supresije rasta gljivica bio je 55 mm.

Primjer 4. Provjera očuvanja i uzimanje u obzir antagonističkog djelovanja soja Pseudomonas putida IB 17, uzgojenog na predloženoj podlozi, provodi se na gore opisani način prema primjeru 3. Prosječni promjer zone supresije rast ispitivane gljive bio je 22 mm.

Pod sličnim uvjetima, uzeta je u obzir antagonistička aktivnost soja Pseudomonas putida IB 17, uzgojenog na dobro poznatoj podlozi King V. Prosječni promjer zone supresije rasta gljive bio je 22 mm.

Rezultati prikazani u tablici 2. ukazuju na očuvanje antagonističkog učinka sojeva bakterija roda Pseudomonas uzgojenih na predloženoj podlozi na test kulturi fitopatogene gljive Bipolaris sorokiniana.

Dakle, korištenje predloženog hranjivog medija koji sadrži autolizat istrošenog pivskog kvasca 7-8 generacija kao izvora aminokiselina za uzgoj bakterija iz roda Pseudomonas, koje imaju antagonističko djelovanje prema gljivičnim fitopatogenima, može značajno smanjiti troškove bioloških proizvoda na bazi ovih mikroorganizama i povećati prinos biomase .

Književnost

1. RF patent 2203945, 7 S12N 1/20, A01N 63/00 // (S12N 1/20, S12R 1:38). Soj bakterije Pseudomonas aureofaciens za dobivanje lijeka protiv bolesti pšenice uzrokovanih gljivičnim fitopatogenima. / Loginov O.N., Sveshnikova E.V., Silishchev N.N., Melentyev A.I., Galimzyanova N.F., Boyko T.F.; proglašen 17.08.2001.; objav. 10.5.2003. Bilten 13.

2. RF patent 2213774, 7 S12N 1/20 // (S12N 1/20, S12R 1:40). Soj bakterije Pseudomonas putida za dobivanje lijeka protiv bolesti pšenice uzrokovanih gljivičnim fitopatogenima. / Loginov O.N., Sveshnikova E.V., Silishchev N.N., Melentyev A.I., Galimzyanova N.F., Boyko T.F., Isaev R.F.; proglašen 25.03.2002.; objav. 10.10.2003. Bilten 28.

3. RF patent 2130265, 6 A01N 63/00 // (A01C 1/00). Metoda borbe protiv biljnih patogena. / Dashkevich V.S., Dashkevich N.Yu., Ashmarina L.F., Shusharo A.I., proglašeno 29.12.97.; objav. 20.05.99. Bilten 14.

4. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. Dva jednostavna medija za demonstraciju piocijanina i fluorescina. //J.Lab. Clin. Med. - 1954. - V.44. - Str.301-307.

5. Smirnov V.V., Kiprianova E.A. Bakterije iz roda Pseudomonas. Kijev, “Naukova Dumka”, 1990. - S.222.

6. Gurevich Yu.L. Stabilnost i regulacija reprodukcije u mikrobnim populacijama. - Novosibirsk, Science, 1984. - P.28-29.

7. Manakov M.N., Pobedimsky D.G. Teorijske osnove mikrobiološke proizvodnje. - M.: Agropromizdat, 1990. - P. 180-181.

8. Perth S.J. Osnove uzgoja mikroorganizama i stanica. M.: Mir, 1978. - str. 147-148.

9. Tepper E.Z., Shilnikova V.K., Pereverzeva G.I. Radionica iz mikrobiologije. - M.: Bustard, 2004. - 256 str.

stol 1
Aminokiselinski sastav peptona i istrošenog kvasca iz raznih pivovara
	Potrošeni kvasac (Ufa, Efes)	Potrošeni kvasac (Sterlitamak, Shikhan-Heineken)	Potrošeni kvasac (Novotroitsk, PIT)	pepton
treonin	5,56%	5,45%	5,25%	2,09%
Valin	4,67%	4,34%	5,34%	2,22%
metionin	1,83%	1,85%	2,00%	0,96%
Izoleucin	5,22%	4,50%	5,30%	1,81%
leucin	6,93%	6,31%	7,03%	2,98%
Tirozin	4,28%	3,72%	4,44%	0,78%
Fenilalanin	4,97%	4,86%	5,37%	2,34%
Lizin	11,07%	10,57%	11,71%	4,85%
cistin	1,24%	1,72%	1,55%	0,23%
Serin	5,35%	5,86%	5,87%	3,50%
Glutaminska kiselina	15,20%	13,70%	13,40%	11,35%
Prolin	5,40%	6,23%	4,87%	14,46%
Glicin	5,78%	5,33%	5,36%	27,33%
Alanin	8,37%	7,42%	7,80%	8,97%
Histidin	3,34%	2,00%	3,47%	0,75%
Arginin	0,79%	6,54%	1,09%	9,52%
Asparaginska kiselina	10,00%	9,60%	10,15%	5,86%

Hranjivi medij za uzgoj bakterija iz roda Pseudomonas koji se koristi za proizvodnju antifungalnih lijekova, koji sadrži izvor aminokiselina, K 2 HPO 4, MgSO 4 ·7H 2 O i vodu, karakteriziran time što je izvor aminokiselina sadrži autolizat istrošenog pivskog kvasca 7-8 generacije i vodu - vodu iz slavine sa sljedećim omjerom komponenti, g/l:

Slični patenti:

Izum se odnosi na medicinu, posebice na epidemiologiju i mikrobiologiju, te se može koristiti u epidemiološkom nadzoru gnojno-septičkih infekcija za identifikaciju bolničkih mikrobnih asocijacija.

Izum se odnosi na biotehnologiju, odnosno na biološki aktivne komplekse, pripravke za medicinu, poljoprivredu i prehrambenu industriju, a može se koristiti za pripremu terapijskih i profilaktičkih pripravaka na bazi živih lakto- i bifidobakterija.