Reproduction d'E.coli dans les milieux nutritifs et ses facteurs. Milieu nutritif pour la culture de bactéries du genre pseudomonas Densité du milieu préparé
La reproduction d'E. coli dans des conditions standards peut être décrite par une courbe qui représente la dépendance du nombre de cellules E. coli en suspension dès la croissance (voir figure dans la présentation). Nombre de cellules E. coli en suspension équivaut à la densité optique d’une culture d’E. coli mesurée à 600 nm (« turbidité en suspension »). Courbe de reproduction E. coli comprend 4 phases principales : (phase initiale, phase de latence), phase exponentielle (exponentielle, phase log), phase stationnaire (phase stationnaire) et phase de mort. Durant la phase initiale de croissance, l’augmentation de la biomasse cellulaire se produit très lentement. Cela est dû au petit nombre de cellules initialement. Lorsque la densité optique de la suspension atteint environ 0,1, la croissance d'E. coli entre dans la phase exponentielle – la phase de croissance rapide. Il a été constaté que pendant la phase exponentielle, la densité optique de la culture double en moyenne toutes les 30 minutes. Lorsque la densité optique de la suspension atteint environ 1,5, en raison du grand nombre de cellules et de la faible quantité de nutriments dans le milieu, la croissance E. coli ralentit considérablement et entre dans la phase stationnaire. Et enfin, un nombre trop important de cellules dans la suspension, un épuisement presque complet du milieu nutritif et une concentration élevée de métabolites bactériens dans celui-ci entraînent la mort des cellules bactériennes, leur lyse et une diminution de la densité de la culture bactérienne ( phase de mort).
Conditions de croissance standards E. coli dans la suspension se trouvent les paramètres suivants : milieu nutritif bouillon LB, température 37 °C, agitation intensive (au moins 150 tr/min) et aération suffisante. Il convient de noter que la croissance E. coli possible non seulement en suspension, mais également sur des milieux nutritifs dits solides contenant de la gélose. Dans ce cas, un mélange intensif n'est pas nécessaire.
Milieux nutritifs pour la croissanceE. coli .
Milieux de culture liquides. Comme mentionné ci-dessus, le milieu de croissance le plus largement utilisé est E. coli en suspension est du milieu LB-bouillon (milieu Luria Bertani, bouillon de lysogénie). Ce milieu hautement nutritif et ses principaux composants sont la tryptone ou peptone, l'extrait de levure et le NaCl. La tryptone (peptone) est un produit de l'hydrolyse de la caséine sous l'action de la trypsine (pepsine) et sert de source d'acides aminés et de peptides. L'extrait de levure est une source de carbone, de vitamines (y compris le groupe B), ainsi que de minéraux tels que les ions magnésium, soufre et calcium ; et NaCl fournit aux cellules bactériennes des ions Na + pour mettre en œuvre un transport efficace et maintenir l'équilibre osmotique. Pour préparer le milieu LB, dissoudre 10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure et 10 g de NaCl (ou 25 g de mélange prêt à l'emploi) dans 1 litre d'eau, autoclaver et laisser refroidir. Il convient de noter que la croissance de diverses souches E. coli dans le milieu LB se produit à des rythmes différents et certaines souches sont très sensibles à une teneur élevée en NaCl. On sait que le NaCl à une concentration de 10 % peut avoir un effet inhibiteur sur la croissance de certaines souches d'E. coli. À cet égard, des protocoles ont été développés pour le milieu LB moyennement salé (5 g NaCl/L LB) et le milieu LB faible en sel (0,5 g NaCl/L) avec des teneurs identiques en peptone et en extrait de levure. La version pauvre en sel du milieu LB est également utilisée si un antibiotique sensible aux concentrations élevées de sel doit être ajouté au milieu de croissance. Le pH du milieu LB sans ajustement supplémentaire est d'environ 7,0 – 7,2.
Normalement, pour atteindre la phase stationnaire, cultivez E. coli devrait durer 14 à 18 heures, cependant, des situations surviennent parfois lorsqu'il est nécessaire de grandir E. coli pendant plusieurs jours (par exemple, pour produire de grandes quantités de biomasse lors de l'expression des protéines). Dans ce cas, l'utilisation du milieu LB n'est pas efficace, car il y a un épuisement des nutriments et une diminution du pH du milieu provoquée par une concentration élevée de métabolites, ce qui initie la mort cellulaire et inhibe leur croissance. Dans de tels cas, pour la croissance E. coli utiliser d’autres milieux contenant des nutriments supplémentaires et des systèmes tampons pour maintenir le pH. Pour augmenter les nutriments, la plupart de ces milieux contiennent le double ou le triple de la quantité de tryptone et d’extrait de levure. De plus, certains milieux incluent : du glycérol ou du glucose comme sources de carbone supplémentaires (médias TB, SOC), un système tampon phosphate ou CaCO 3, qui empêchent l'acidification du milieu et maintiennent son pH en phase stationnaire de croissance E. coli(environnement TB), ainsi que les sels Mg 2+ et K + (environnements 2*YT, SOB, SOC).
Pour la croissance E. coli Les milieux de culture liquides utilisent généralement des flacons en verre coniques pré-stérilisés ou traités à l'alcool ou des tubes Falcon en plastique de 50 ml. Expansion de la biomasse E. coli pour l'isolement ultérieur de l'ADN plasmidique, il est généralement effectué pendant la nuit, c'est-à-dire qu'une culture « pendant la nuit » est obtenue. Pour ce faire, une petite quantité de bactéries prétransformées avec un plasmide est placée dans un flacon ou un tube en plastique contenant un milieu en présence de l'antibiotique requis et la culture est cultivée à 37°C et 150 tr/min pendant 14 à 18 heures. . La culture « de nuit » terminée est une suspension trouble de cellules dans le milieu. Pour mettre en œuvre certaines tâches (par exemple, obtenir des cellules compétentes ou exprimer des protéines recombinantes), il est nécessaire de faire croître des cellules jusqu'à certaines valeurs OD600 (généralement 0,3 – 0,8). Dans de tels cas, il est nécessaire de surveiller la densité optique de la culture en croissance afin de ne pas manquer le moment d'atteindre la densité optique souhaitée.
Milieux nutritifs solides. Un milieu nutritif solide est utilisé lorsqu'il est nécessaire d'obtenir des colonies uniques E. coli. Ceci est généralement nécessaire lorsque les cellules sont transformées avec un mélange hétérogène d'ADN plasmidique (par exemple, dans le cas d'un mélange de ligase) et qu'il est nécessaire de trouver une colonie contenant la variante correcte du plasmide. Généralement dans le cas de milieux de croissance solides E. coli utilisez des gobelets en plastique jetables d'un diamètre de 90 mm. Le milieu de culture solide le plus courant est la gélose à 1,5% préparée sur LB (LB agar). Pour préparer 1 litre d'un tel milieu, il faut dissoudre 15 g d'agar, 10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure et 10 g de NaCl (ou 25 g du mélange LB préparé) dans 1 litre d'eau distillée et autoclaver. . La gélose doit être refroidie à une température de 50°C - 60°C, l'antibiotique nécessaire doit y être ajouté, versé dans des coupelles à raison d'environ 10 ml par coupelle et laissé durcir sous une laminaire à côté du brûleur, avec le couvercle. légèrement ouvert. Une fois la condensation évaporée, la coupelle peut être utilisée pour inoculer des bactéries.
Température. Avec une diminution de la température, l'augmentation E. coli ralentit, mais dans certains cas, E. coli est cultivé à des températures plus basses pendant plusieurs jours, par exemple lorsqu'il est cuit à partir d'une culture E. coli cellules compétentes ou lors de l'expression de protéines recombinantes.
Agitation et aération. Pour assurer une aération suffisante, cultivez E. coli en suspension, il faut agiter intensivement (au moins 150 tr/min) et le récipient (flacon ou tube à essai en plastique) doit être rempli du milieu jusqu'à un maximum de 1/10 du volume total. Pour améliorer l'aération, les couvercles des tubes utilisés pour la croissance de la culture bactérienne sont fermés sans serrer et du papier d'aluminium est utilisé pour fermer les flacons. Dans certains cas, des flacons dotés de lames internes spéciales - des « pare-chocs » sont utilisés. Lors de l'agitation dans de tels flacons, la surface de contact entre le milieu et l'air augmente sensiblement en raison des éclaboussures du liquide. Plus il y a de pare-chocs dans le ballon, plus les éclaboussures de liquide sont fortes et plus l'aération est élevée. En cas de croissance E. coli sur un milieu nutritif solide, l'aération se produit du fait qu'un certain espace est prévu entre les parois de la boîte bactérienne et le couvercle pour la pénétration de l'air.
Antibiotiques Comme mentionné ci-dessus, la plupart des plasmides contiennent un gène de résistance aux antibiotiques, en présence duquel il existe une sélection de cellules contenant le plasmide parmi les cellules qui ne le contiennent pas. Les antibiotiques les plus largement utilisés pour la sélection sont l'ampicilline (concentration de travail - 100 μg/ml), la kanamycine (concentration de travail - 30 μg/ml) et le chloramphénicol (concentration de travail - 25-30 μg/ml). Les antibiotiques sont généralement dissous dans de l'éthanol ou de l'eau (chaque antibiotique a ses propres conditions de solubilité), des solutions mères mille fois sont préparées et conservées à -20°C. Avant d’ajouter des antibiotiques à la gélose LB, il est nécessaire de la refroidir à 50-60°C, car les antibiotiques sont facilement détruits à haute température. Certains antibiotiques, comme l'ampicilline, sont sensibles à la lumière, il est donc conseillé de cultiver des bactéries en leur présence dans l'obscurité.
Ces milieux sont utilisés pour cultiver et stocker des souches recombinantes Escherichia coli, ainsi que pour la culture habituelle de micro-organismes peu exigeants.
Composé**:
** La composition a été vérifiée et ajustée pour répondre aux paramètres requis
Préparation:
Mélanger 35,0 g de poudre M557 ou 20,0 g de poudre M575 ou 40,0 g de poudre M1151 ou 25,0 g de poudre M1245 dans 1 000 ml d'eau distillée. Chauffer pour dissoudre complètement les particules. Stériliser en autoclave à 1,1 atm (121°C) pendant 15 minutes. Verser dans des récipients appropriés.
Principe et évaluation du résultat :
La gélose et le bouillon Luria sont préparés selon la recette Lennox (1) pour la culture et le stockage de souches recombinantes Escherichia coli. Les milieux restants (2) sont légèrement différents dans la mesure où ils contiennent le double de la concentration en chlorure de sodium. Ces milieux contiennent suffisamment de nutriments pour la croissance de souches recombinantes. Ces souches sont généralement des dérivés Escherichia coli K12, déficient dans la synthèse de la vitamine B. À cause de cela et d'autres marqueurs d'auxotrophie obtenus lors de la mutagenèse, les souches recombinantes peuvent perdre la capacité de se développer sur des milieux de composition appauvrie.
L'hydrolysat de caséine assure la présence de peptides dans le milieu, d'extrait de levure - vitamines B, chlorure de sodium - ions sodium pour le transport membranaire et le maintien d'une pression osmotique optimale.
Contrôle de qualité:
Aspect poudre :
Poudre jaune clair homogène et fluide.
Densité du support fini :
Un milieu est formé correspondant en densité à un gel d'agar à 1,5% (M557 ou M1151).
Couleur et transparence du support fini :
Le milieu est de couleur jaune ou ambrée, transparent ou légèrement opalescent si un gel se forme dans des éprouvettes ou des boîtes de Pétri.
Acidité du milieu :
À 25°C, les solutions aqueuses de M557 (3,5 % p/v) ou M575 (2,0 % p/v) ont un pH de 7,0 ± 0,2, et les solutions aqueuses de M1151 (4,0 % p/v) ou M1245 (2,5 % p/v) ont un pH de 7,5 ± 0,2.
Sujet : Isolement et purification des protéinespkb5
partie expérimentale
Souches et médias.
La souche utilisée dans ce travail E. coliB.L.21(DE3) pLysS, avec le plasmide pET32a:Pkb5 (Fig), contenant le domaine catalytique de la protéine kinase pkb5 de Bifidobacterium longum.
Pour les cellules en croissance E. coli Des milieux nutritifs LB et TB ont été utilisés.
Tableau 1 - Milieux nutritifs utilisés pour la culture E. coli
Les milieux ont été stérilisés dans un autoclave sous une surpression de 0,8 atm pendant 40 minutes.
Pour maintenir la tension E. coliB.L.21(DE3) pLysS, contenant le plasmide pET32a:Pkb5, un tamisage monoclonal a été réalisé sur boîtes de Pétri avec du milieu gélose LB additionné de chloramphénicol (30 µg/ml) et d'ampicilline (150 µg/ml).
Pour générer de la biomasse cellulaire E. coliB.L.21(DE3) pLysS, contenant le plasmide pET32a: Pkb5, ont été cultivés dans des flacons sur milieu TV avec addition de chloramphénicol et d'ampicilline.
Dans un premier temps, les cultures nocturnes ont été cultivées en milieu TV. Lors de la deuxième étape, 1,5 culture d'une nuit ont été ajoutées à des flacons contenant 150 ml de milieu frais. La culture a été réalisée dans des conditions aérées à 250 tr/min et à une température de 37 0 C jusqu'à ce que la densité optique OD 600 = 0,6 (~ 2 heures), puis l'expression a été induite en ajoutant de l'IPTG (isopropyl - β-D-thiogalactoside) à un mélange final. concentration de 0,5 mm. Ensuite, la culture a été réalisée à 28°C pendant 18 heures, après quoi la biomasse a été agglomérée par centrifugation pendant 10 minutes à 6 000 tr/min, lavée avec du Tris-HCl 1M (pH 7,6-8,0) et congelée à -20°C.
Riz. Schéma de construction du plasmide pET32a : Pkb5 .
Préparation du lysatE .Avec oli
Cellules décongelées E.Avecolià une température de 4°C. Les cellules décongelées ont été lavées du milieu de croissance avec 20 volumes (18 ml) de Tris-HCl 1 M, pH 7,8. Les cellules ont été agglomérées par centrifugation à 7 500 tr/min pendant 10 min à une température de 4 0 C. Le poids du sédiment a été déterminé à 1,61 g sur une balance analytique. Les sédiments ont été remis en suspension dans 10 volumes de tampon de lyse contenant 300 mM de KCl. , KH2PO4 50 mM, Imidazole 5 mM, cocktail d'inhibiteurs d'urée 6 M (complet sans EDTA, Roche Diagnostics Gmbh, Allemagne). Les cellules ont été lysées à l'aide d'un désintégrateur à ultrasons SONICS VIBRA CELL 3 fois pendant 59 secondes avec un intervalle de 15 secondes à une amplitude de 40 % et à une température de 4 0 C. Pour sédimenter les fragments de paroi cellulaire, le lysat a été centrifugé à 10 000 tr/min pendant 20 minutes à une température de 4°C. Le surnageant a été collecté et filtré à travers un filtre (diamètre de pores de 0,22 µm, Merck Millipore Ltd, Allemagne) immédiatement avant application à la colonne.
Chromatographie d'affinité métallique
La méthode de chromatographie d'affinité métallique est basée sur l'interaction non covalente du fragment 6 histidine de la protéine recombinante (His-Tag) avec les ions nickel (Ni 2+), formant des liaisons de coordination avec les résidus d'acide nitroacétique.
La purification a été effectuée sur un collecteur de fractions Bio Logic LP modèle 2110 (Bio Rad, USA) en utilisant une colonne de cartouches Bio-Scale Mini Profinity IMAC de 1 ml.
La purification des protéines a été réalisée conformément au manuel de méthode Profinite IMAC Resins (Bio Rad, USA).
Avant de commencer le travail, le système a été lavé avec de l'eau distillée, une colonne de cartouches Bio-Scale Mini Profinity IMAC a été installée et la colonne a été lavée avec de l'eau distillée à un débit de 2 ml/min. La colonne a été équilibrée avec 8 volumes de tampon de lyse à raison de 2 ml/min, le lysat a été appliqué dans un volume de 15 ml à raison de 0,5 ml/min, lavé avec 15 volumes de tampon de lyse à raison de 2 ml. /min, puis lavé avec 15-3 volumes de tampon de lavage à un débit de 2 ml/min, l'élution a été réalisée avec 15 volumes de tampon d'élution à un débit de 2 ml/min. Les fractions ont été collectées dans des volumes de 2 ml. Les fractions correspondant à la protéine éluée ont été collectées séparément.
En fin de travail, la colonne a été lavée avec 2 ml d'eau distillée à raison de 2 ml/min et régénérée avec 5 volumes de guanidine-HCl 6 M puis avec de l'eau distillée. La colonne utilisée a été stockée dans de l'éthanol à 20 % à 4 0 C.
Composition de la solution tampon
Détermination de la quantité de protéines
Les quantités de protéines ont été déterminées en utilisant la méthode de Bradford (Bradford M.M., 1976).
À l'aide d'un spectrophotomètre numérique PD-303, la densité optique à une longueur d'onde de 595 nm a été déterminée pour les fractions 31 et 32 et la quantité de protéine a été déterminée à partir du graphique (Fig.) et la concentration a été calculée.
Composition de la peinture : 100 mg de CBB (Coomassie Brilliant Blue G-250), 95 % C 2 H 5 OH, 85 % H 3 PO 4
Riz. Graphique pour déterminer la quantité d'échantillon de test à l'aide de la méthode Breedford
Dialyse par étapes
Les tubes de dialyse utilisés dans le travail étaient des tubes de dialyse plissés SnakeSkin (Thermo scientific), diamètre de pores 3 500 MVCO.
Les fractions sélectionnées ont été dialysées contre une solution tampon contenant 50 mM de Tris-HCl, 5 mM de β-mercaptoéthanol, 10 % de glycérol, 3 M d'urée à une température de 4 0 C pendant 2,5 heures sous agitation constante. Ensuite, le tampon de dialyse a été remplacé par un tampon de dialyse contenant 50 mM de Tris-HCl, 5 mM de β-mercaptoéthanol, 10 % de glycérol, 1,5 M d'urée, 2 mM de MgCl2. Laissé une nuit sous agitation constante à 4 0 C.
Séparation électrophorétique des protéines dans un gel dénaturant de SDS-polyacrylamide
L'électrophorèse a été réalisée selon la méthode Laemmli (Laemmli U. K., 1970) en utilisant un système Mini Proteam. Un gel de Polyacrylamide à 12 % dans un tampon contenant du Tris-HCl 0,375 M pH 8,8, 0,1 % de SDS a été utilisé comme gel de travail ; un gel de Polyacrylamide à 3 % contenant du Tris-HCl 0,125 M pH 6,8 a été utilisé comme gel de formation. 0,1 % de SDS .
Le tampon d'électrode était du Tris 0,025 M, de la glycine 0,192 M, du SDS à 0,1 %.
Avant l'application, les échantillons ont été chauffés dans un tampon contenant du Tris-HCl 0,0625 M pH 6,8, 2,3 % de SDS, 5 % de β-mercaptoéthanol, 10 % de glycérol et 0,001 % de bleu de brome phénol. L'électrophorèse a été réalisée sous une tension constante de 200 volts. En fin d'électrophorèse, le PAGE a été fixé pendant 30 min dans une solution contenant 50% de C2H5OH et 10% de CH3COOH. Ensuite, la coloration a été réalisée dans une solution contenant 0,2 % de SBB g-250, 40 % de C2H5OH, 8 % de CH3COOH avec chauffage. La PAGE a été lavée dans du CH3COOH à 7 %.
Concentration
Pour mesurer davantage l'activité du domaine catalytique pkb5, la protéine éluée a été concentrée en utilisant des filtres ultra centrifuges Amicon, diamètre de pores 50 000 NMWL (Merck Millipore Ltd).
La concentration de l'échantillon protéique a été réalisée par centrifugation Eppendorf 5430 R à 7500 tr/min pendant 1 heure 20 minutes à une température de 4 0 C.
Contrôle d'activité
La détermination de l'autophosphorylation de pkb 5 (protéine recombinante) a été réalisée à l'aide du Kinase-Glo r Plus Luminiscent Kinase Assey (Promega V3772), utilisé pour mesurer l'étendue de la phosphorylation par le niveau d'ATP restant pendant la réaction.
A l'aide d'un poste automatisé Biomek 3000 Beckman Coulter©, 15 µl de solution de pkb 5 (5 µg et 1 µg dans le mélange réactionnel) dans du tampon réactionnel (HEPES 15 mM pH 7,4 ; NaCl 20 mM, MgCl 2 10 mM, EDTA 0,5 mM, 0,02% Tween-20, 10 mg/ml BSA) et 15 µl de tampon de réaction (témoin sans protéine kinase).
20 µM d'ATP (15 µl) ont été ajoutés à chaque puits et le contenu des puits a été mélangé. Incuber à température ambiante pendant 30 min en recouvrant la plaque d'un couvercle pour éviter l'évaporation.
A la fin de la réaction enzymatique, 30 µl du réactif de détermination de la luminescence ont été ajoutés dans chaque puits, la plaque a été incubée pendant 40 minutes à température ambiante et la luminescence a été mesurée sur un détecteur multimode Beckman Coulter© DTX 880.
La discussion des résultats
Au stade de la chromatographie d'affinité métallique, il a été déterminé à partir du chromatogramme que la protéine pkb 5 étudiée était contenue dans les fractions 31 et 32.
Fig. Chromatogramme de l'isolement du domaine catalytique pkb 5
Les fractions 31 et 32 ont été combinées car elles contenaient la protéine étudiée.
Le domaine catalytique de pkb5 ayant été isolé dans des conditions dénaturantes, il était nécessaire de replier cette protéine pour une étude plus approfondie.
Dans l'étape suivante, les fractions regroupées ont été dialysées pour replier pkb5 des conditions dénaturantes aux conditions natives.
À l'étape suivante, pour vérifier les conditions optimales de purification chromatographique de pkb5 de diverses fractions, une séparation électrophorétique des protéines a été réalisée dans un gel dénaturant de SDS-polyacrylamide.
Riz. Électrophérogramme obtenu à la suite de la purification de pkb5 ; a) 1- lysat, 2- fractions 13-20, 3- fractions 26-27, 4- fraction 31, 5- échantillon à tester après dialyse, 6- marqueurs de protéines (marqueur de poids moléculaire de protéine présouillé, 20-120 kDa) ; b) 1- lysat, 2- fractions 13-20, 3- fractions 26-27, 4- fraction 31, 5- protéines marqueurs (marqueur protéique précoloré, large plage, 7-175 kDa), 6- échantillon test après dialyse
Le tableau (..) indique la quantité finale de protéines appliquée à l'électrophorèse.
Tableau(..)
À l'étape suivante après la dialyse par étapes, la concentration de la protéine étudiée pkb 5 a été augmentée pour une mesure plus approfondie de l'activité.
L'activité phosphotransférase du domaine catalytique de pkb5 a été précédemment testée. Employés du laboratoire de génétique des micro-organismes chercheur principal, Ph.D. Mavletova D. A. et chercheuse junior Mironcheva T. A. IOGen im. N.I. Vavilova RAS a réalisé l'autophosphorylation du domaine catalytique de pkb5 en utilisant du [γ-32P]-ATP (Fig.).
UN) 
b) 
Riz. a) Électrophérogramme de l'autophosphorylation de pkb5. b) Autoradiogramme de l'autophosphorylation de pkb5
Contrôle d'activité
Le réactif Kinase-Glo utilise la quantité résiduelle d'ATP comme substrat pour la luciférase Ultra-Glo TM, catalysant la monooxygénation de la luciférine pour produire un photon de lumière (Figure 1). L'activité de la protéine kinase est inversement proportionnelle à l'intensité du signal de luminescence. 
Riz. 1. Schéma de réaction Kinase-Glo® Assey
Sur la base des données luminescentes, un graphique a été construit de la dépendance du pourcentage d'autophosphorylation sur la quantité de protéine kinase pkb 5 ( riz.).
Riz. Pourcentage d'autophosphorylation du pkb 5
Titulaires du brevet RU 2303061 :
L'invention concerne la biotechnologie et peut être utilisée pour cultiver des bactéries Pseudomonas. Le milieu nutritif contient comme source d'acides aminés l'autolysat de levure épuisée de 7-8ème génération, K 2 HPO 4, MgSO 4 × 7H 2 O et de l'eau du robinet. L'invention permet d'augmenter le rendement en biomasse de bactéries du genre Pseudomonas. 2 tableaux
Le milieu nutritif peut être utilisé en biotechnologie pour cultiver des bactéries du genre Pseudomonas afin d'obtenir des produits biologiques à base de ces micro-organismes présentant une activité antagoniste contre les phytopathogènes fongiques.
Il existe des souches connues de bactéries du genre Pseudomonas qui ont une activité antagoniste envers les phytopathogènes fongiques et sont utilisées pour obtenir des médicaments contre les maladies du blé provoquées par des phytopathogènes fongiques.
On connaît le milieu nutritif LB, qui est l'un des principaux pour la culture de bactéries du genre Pseudomonas - productrices de substances ayant une activité fongicide et composées, en g/l :
Peptone - 10
Extrait de levure - 5
Chlorure de sodium - 10
Eau du robinet jusqu'à 1 litre.
L'inconvénient du milieu nutritif est son coût élevé, car il contient un composant aussi coûteux que la peptone (environ 700 roubles/kg).
Le milieu nutritif connu King B, adopté comme prototype, est également utilisé pour cultiver des bactéries du genre Pseudomonas. Il comprend de la peptone, de la glycérine, divers sels minéraux, g/l :
Peptone - 20
Glycérine - 10
K 2 HPO 4 - 1,5
MgSO 4 7H 2 O - 1,5
Eau distillée jusqu'à 1 litre.
Son inconvénient est également le coût élevé associé à la présence dans sa composition d'un ingrédient aussi coûteux que la peptone.
Dans la production industrielle de produits biologiques à base de bactéries du genre Pseudomonas, destinés à être utilisés en culture végétale, le coût élevé du milieu nutritif entraînera inévitablement une augmentation du prix du produit cible.
L'objectif technique de l'invention proposée est de réduire le coût du milieu nutritif pour cultiver des bactéries du genre Pseudomonas et d'augmenter le rendement en biomasse.
La tâche technique indiquée consistant à réduire le coût d'un milieu nutritif pour la culture de bactéries du genre Pseudomonas et à augmenter le rendement de la biomasse est résolue en utilisant un milieu nutritif de composition suivante, g/l :
Autolysat de levure de bière épuisée 7-8 générations (matière sèche) - 26,8
K 2 HPO 4 - 1,5
MgSO 4 7H 2 O - 1,5
Eau du robinet jusqu'à 1 litre.
La levure de bière épuisée de la 7e à la 8e génération n'est pas utilisée dans la production de bière, car les cellules de cette levure ne sont plus capables de remplir leur fonction principale pendant le processus de fermentation ; ils perdent également leur capacité à se reproduire. Le nombre de cellules mortes dans une telle génération atteint 89 %, avec une faible activité vitale - jusqu'à 10 %. Actuellement, la levure de bière épuisée ne trouve pas d'utilisation qualifiée et, en règle générale, est rejetée dans les égouts. Dans le même temps, la levure de bière épuisée contient des quantités importantes de vitamines B, PP et E, ainsi que tous les acides aminés essentiels.
Les cultures microbiennes lors de leur culture sont très sensibles à la composition du milieu nutritif. Avec une sélection réussie de tous les composants en termes de composition qualitative et quantitative, en particulier l'ensemble des acides aminés, le milieu assure une croissance et un développement assez rapides de la population de micro-organismes et est considéré comme équilibré. Dans les protéines cellulaires, les acides aminés individuels représentent 1 à 5 % de la protéine totale, à partir de laquelle la quantité d'acides aminés nécessaires en tant que facteurs de croissance peut être estimée approximativement. L'exception concerne l'acide glutamique et la glutamine, qui jouent quantitativement un rôle important dans le métabolisme des acides aminés et dont la teneur dans le milieu devrait largement dépasser la teneur des autres acides aminés. Le tableau 1 montre la composition en acides aminés déterminée par nos soins de la levure de bière épuisée provenant de divers fabricants de bière, ainsi qu'un échantillon de peptone commerciale destinée à être utilisée dans certains milieux nutritifs en microbiologie.
Comme il ressort des données du tableau 1, l'acide glutamique est présent en quantités importantes dans la composition de la levure de bière épuisée et sa teneur en pourcentage est supérieure à celle de la peptone. Il convient également de noter que la teneur en tous les acides aminés essentiels est supérieure à celle de la peptone, ce qui indique une composition en acides aminés plus équilibrée du composant proposé du milieu nutritif.
Le milieu nutritif proposé est préparé comme suit.
Pour obtenir l'autolysat, la levure de bière épuisée de la 7ème-8ème génération est soumise à un traitement thermique à 100°C pendant une heure.
Des composants minéraux sont ajoutés à l'autolysat de levure, le volume du mélange obtenu est ajusté à 1 litre avec de l'eau du robinet et autoclavé. De l'inoculum est ajouté (40 ml de culture bactérienne Pseudomonas). La souche est cultivée pendant 48 heures à 28-30°C avec une aération constante. Ensuite, le titre dans le liquide de culture est déterminé par une méthode de dilution connue.
Exemple 1. Un milieu nutritif de composition suivante est préparé. A 26,8 g d'autolysat de levure ajouter 1,5 g de K 2 HPO 4 et 1,5 g de MgSO 4 · 7H 2 O, porter le volume du mélange obtenu à 1 litre avec de l'eau du robinet et autoclave. Puis 40 ml de la culture bactérienne Pseudomonas aureofaciens IB 51 sont inoculés dans le milieu nutritif. La fermentation est réalisée pendant 48 heures à 28-30°C avec aération constante. Le titre du liquide de culture en fin de fermentation est de 5.10 11 UFC/ml.
Dans des conditions similaires, la souche Pseudomonas aureofaciens IB 51 est cultivée sur le milieu connu King V. Le nombre de micro-organismes à la fin du processus de culture était de 3,10 10 UFC/ml.
Exemple 2. Le milieu nutritif est préparé comme décrit ci-dessus selon l'exemple 1 et 40 ml de culture Pseudomonas putida IB 17 sont inoculés. La fermentation est réalisée de manière similaire selon l'exemple 1. Le titre du liquide de culture en fin de fermentation est de 5.10 11 UFC/ml.
Dans des conditions similaires, la souche Pseudomonas putida IB 17 est cultivée sur le milieu connu King V. Le nombre de micro-organismes à la fin du processus de culture était de 6,10 10 UFC/ml.
Le tableau 2 présente les résultats de culture de bactéries du genre Pseudomonas sur milieu King B (selon le prototype) et le milieu proposé. Comme on peut le constater, le titre le plus élevé de bactéries du genre Pseudomonas est maintenu dans des échantillons où le milieu nutritif contient, à la place de la peptone et du glycérol, l'autolysat de levure de bière épuisée de 7e-8e génération.
Exemple 3. Test de préservation de l'activité antagoniste de la souche Pseudomonas aureofaciens IB 51 cultivée sur le milieu proposé.
Une suspension de spores fongiques phytopathogènes (Bipolaris sorokiniana). Ensuite, des bactéries de la souche Pseudomonas aureofaciens IB 51, cultivées sur le milieu proposé, sont plantées par injection sur les mêmes plaques. Les boîtes sont incubées à 28°C pendant 3 jours.
La prise en compte de l'activité antagoniste est effectuée par le diamètre moyen de la zone d'absence ou de suppression de croissance du champignon testé autour de la colonie de la souche. Pour Bipolaris sorokiniana, elle était de 55 mm.
Dans des conditions similaires, on prend en compte l'activité antagoniste de la souche Pseudomonas aureofaciens IB 51, cultivée sur le milieu bien connu King V. Le diamètre moyen de la zone de suppression de croissance fongique était de 55 mm.
Exemple 4. Le contrôle de la conservation et la prise en compte de l'activité antagoniste de la souche Pseudomonas putida IB 17, cultivée sur le milieu proposé, est réalisé de la manière décrite ci-dessus selon l'exemple 3. Le diamètre moyen de la zone de suppression du la croissance du champignon testé était de 22 mm.
Dans des conditions similaires, on prend en compte l'activité antagoniste de la souche Pseudomonas putida IB 17, cultivée sur le milieu bien connu King V. Le diamètre moyen de la zone de suppression de croissance fongique était de 22 mm.
Les résultats sont présentés dans le tableau 2 et indiquent la préservation de l'effet antagoniste des souches de bactéries du genre Pseudomonas cultivées sur le milieu proposé sur la culture test du champignon phytopathogène Bipolaris sorokiniana.
Ainsi, l'utilisation du milieu nutritif proposé contenant un autolysat de levure de bière épuisée de 7e à 8e génération comme source d'acides aminés pour la culture de bactéries du genre Pseudomonas, qui ont une activité antagoniste envers les phytopathogènes fongiques, peut réduire considérablement le coût. de produits biologiques à base de ces micro-organismes et augmenter le rendement de la biomasse.
Littérature
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2. Brevet RF 2213774, 7 С12N 1/20 // (С12N 1/20, С12R 1:40). Souche de bactérie Pseudomonas putida pour obtenir un médicament contre les maladies du blé causées par des phytopathogènes fongiques. / Loginov O.N., Sveshnikova E.V., Silishchev N.N., Melentyev A.I., Galimzyanova N.F., Boyko T.F., Isaev R.F. ; déclaré le 25/03/2002 ; publi. 10.10.2003. Bulletin 28.
3. Brevet RF 2130265, 6 A01N 63/00 // (A01C 1/00). Une méthode de lutte contre les agents pathogènes des plantes. / Dashkevich V.S., Dashkevich N.Yu., Ashmarina L.F., Shusharo A.I., déclaré le 29/12/97 ; publi. 20.05.99. Bulletin 14.
4. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. Deux milieux simples pour la démonstration de la pyocyanine et de la fluorescine. //J.Lab. Clin. Méd. - 1954. - V.44. - P.301-307.
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6. Gourevitch Yu.L. Stabilité et régulation de la reproduction dans les populations microbiennes. - Novossibirsk, Science, 1984. - P.28-29.
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9. Tepper E.Z., Shilnikova V.K., Pereverzeva G.I. Atelier de microbiologie. - M. : Outarde, 2004. - 256 p.
| Tableau 1 | ||||
| Composition en acides aminés de la peptone et de la levure épuisée de diverses brasseries | ||||
| Levure épuisée (Ufa, Efes) | Levure épuisée (Sterlitamak, Shikhan-Heineken) | Levure épuisée (Novotroitsk, PIT) | peptone | |
| Thréonine | 5,56% | 5,45% | 5,25% | 2,09% |
| Valin | 4,67% | 4,34% | 5,34% | 2,22% |
| Méthionine | 1,83% | 1,85% | 2,00% | 0,96% |
| Isoleucine | 5,22% | 4,50% | 5,30% | 1,81% |
| Leucine | 6,93% | 6,31% | 7,03% | 2,98% |
| Tyrosine | 4,28% | 3,72% | 4,44% | 0,78% |
| Phénylalanine | 4,97% | 4,86% | 5,37% | 2,34% |
| Lysine | 11,07% | 10,57% | 11,71% | 4,85% |
| Cystine | 1,24% | 1,72% | 1,55% | 0,23% |
| Sérine | 5,35% | 5,86% | 5,87% | 3,50% |
| Acide glutamique | 15,20% | 13,70% | 13,40% | 11,35% |
| Proline | 5,40% | 6,23% | 4,87% | 14,46% |
| Glycine | 5,78% | 5,33% | 5,36% | 27,33% |
| Alanine | 8,37% | 7,42% | 7,80% | 8,97% |
| Histidine | 3,34% | 2,00% | 3,47% | 0,75% |
| Arginine | 0,79% | 6,54% | 1,09% | 9,52% |
| L'acide aspartique | 10,00% | 9,60% | 10,15% | 5,86% |
Milieu nutritif pour la culture de bactéries du genre Pseudomonas utilisé pour la production de médicaments antifongiques, contenant une source d'acides aminés K 2 HPO 4, MgSO 4 ·7H 2 O et de l'eau, caractérisé en ce qu' en tant que source d'acides aminés il contient de l'autolysat de levure de bière épuisée de 7-8ème génération et de l'eau - eau du robinet avec le rapport de composants suivant, g/l :
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