تکثیر باکتری E.coli در محیط های غذایی و عوامل آن. محیط غذایی برای کشت باکتری های جنس سودوموناس تراکم محیط تهیه شده

تولید مثل E. coli در شرایط استاندارد را می توان با یک منحنی توصیف کرد که نشان دهنده وابستگی تعداد سلول ها است. E.coliدر حالت تعلیق از زمان رشد (به شکل در ارائه مراجعه کنید). تعداد سلول ها E.coliدر سوسپانسیون معادل چگالی نوری یک کشت E. coli است که در 600 نانومتر اندازه‌گیری شده است ("کدورت سوسپانسیون"). منحنی تولید مثل E.coliشامل 4 فاز اصلی (فاز اولیه، فاز تاخیر)، فاز نمایی (نمایی، لگ فاز)، فاز ساکن (فاز ثابت) و فاز مرگ. در مرحله رشد اولیه، افزایش زیست توده سلولی بسیار آهسته اتفاق می افتد. این به دلیل تعداد سلول های اولیه کم است. هنگامی که چگالی نوری سوسپانسیون تقریباً به 0.1 می رسد، رشد E. coli وارد فاز نمایی - فاز رشد سریع می شود. مشخص شد که در مرحله نمایی، چگالی نوری کشت به طور متوسط ​​هر 30 دقیقه دو برابر می شود. هنگامی که چگالی نوری سوسپانسیون تقریباً 1.5 می شود، به دلیل تعداد زیاد سلول ها و مقدار کمی مواد مغذی در محیط، رشد می کند. E.coliبه طور قابل توجهی کند می شود و وارد فاز ثابت می شود. و در نهایت، تعداد بیش از حد سلول های موجود در سوسپانسیون، تخلیه تقریبا کامل محیط غذایی و غلظت بالای متابولیت های باکتری در آن منجر به مرگ سلول های باکتریایی، لیز آنها و کاهش تراکم کشت باکتری می شود. مرحله مرگ).

شرایط رشد استاندارد E.coliدر سوسپانسیون پارامترهای زیر وجود دارد: محیط غذایی LB-broth، دمای 37 درجه سانتیگراد، هم زدن شدید (حداقل 150 دور در دقیقه) و هوادهی کافی. لازم به ذکر است که رشد E.coliنه تنها در سوسپانسیون، بلکه در محیط های به اصطلاح مواد مغذی جامد حاوی آگار نیز امکان پذیر است. در این مورد، اختلاط فشرده لازم نیست.

محیط های غذایی برای رشدE.coli .

محیط کشت مایع. همانطور که در بالا ذکر شد، پرمصرف ترین محیط رشد است E.coliدر سوسپانسیون محیط LB-broth (محیط لوریا برتانی، لیزوژنی براث) است. این محیط بسیار مغذی و اجزای اصلی آن تریپتون یا پپتون، عصاره مخمر و NaCl است. تریپتون (پپتون) محصولات هیدرولیز کازئین تحت اثر تریپسین (پپسین) است و به عنوان منبع اسیدهای آمینه و پپتیدها عمل می کند. عصاره مخمر منبع کربن، ویتامین ها (از جمله گروه B) و همچنین مواد معدنی مانند یون های منیزیم، گوگرد و کلسیم است. و NaCl سلول های باکتریایی را با یون Na + برای اجرای انتقال موثر و حفظ تعادل اسمزی فراهم می کند. برای تهیه محیط LB 10 گرم تریپتون، 5 گرم عصاره مخمر و 10 گرم نمک طعام (یا 25 گرم مخلوط آماده) را در 1 لیتر آب حل کرده و در اتوکلاو سرد کنید. لازم به ذکر است که رشد سویه های مختلف E.coliدر محیط LB با سرعت های مختلف رخ می دهد و برخی از سویه ها به محتوای بالای NaCl بسیار حساس هستند. مشخص شده است که نمک طعام در غلظت 10 درصد می تواند اثر مهاری بر رشد برخی از سویه های E. coli داشته باشد. در این راستا، پروتکل‌هایی برای محیط LB با نمک متوسط ​​(5 گرم NaCl/L LB) و محیط LB کم نمک (0.5 گرم NaCl/L) با محتوای پپتون و عصاره مخمر یکسان ایجاد شد. نسخه کم نمک محیط LB نیز اگر قرار باشد آنتی بیوتیک حساس به غلظت نمک بالا به محیط رشد اضافه شود استفاده می شود. pH محیط LB بدون تنظیم اضافی تقریباً 7.0 - 7.2 است.

به طور معمول، برای رسیدن به فاز ثابت، رشد کنید E.coliباید 14-18 ساعت باشد، با این حال، گاهی اوقات شرایطی ایجاد می شود که رشد لازم باشد E.coliبرای چند روز (به عنوان مثال، برای تولید مقادیر زیادی از زیست توده در طول بیان پروتئین). در این مورد، استفاده از محیط LB موثر نیست، زیرا کاهش مواد مغذی و کاهش PH محیط ناشی از غلظت بالای متابولیت ها وجود دارد که باعث شروع مرگ سلولی و مهار رشد آنها می شود. در چنین مواردی برای رشد E.coliاز سایر محیط های حاوی مواد مغذی اضافی و سیستم های بافر برای حفظ pH استفاده کنید. برای افزایش مواد مغذی، بیشتر این محیط ها حاوی دو یا سه برابر مقدار تریپتون و عصاره مخمر هستند. علاوه بر این، برخی از محیط ها عبارتند از: گلیسرول یا گلوکز به عنوان منابع کربن اضافی (محیط TB، SOC)، سیستم بافر فسفات یا CaCO 3 که از اسیدی شدن محیط جلوگیری می کند و pH آن را در فاز ثابت رشد حفظ می کند. E.coli(محیط TB)، و همچنین نمک های Mg 2+ و K + (محیط های 2*YT، SOB، SOC).

برای رشد E.coliمحیط های کشت مایع معمولاً از فلاسک های شیشه ای مخروطی شکل از پیش استریل شده یا تیمار شده با الکل یا لوله های پلاستیکی فالکون 50 میلی لیتری استفاده می کنند. گسترش زیست توده E.coliبرای جداسازی بعدی DNA پلاسمید، معمولاً یک شبه انجام می شود، یعنی یک کشت "یک شبه" به دست می آید. برای انجام این کار، مقدار کمی از باکتری از قبل تبدیل شده با یک پلاسمید در یک فلاسک یا لوله پلاستیکی با محیطی در حضور آنتی بیوتیک مورد نیاز قرار داده می شود و کشت در دمای 37 درجه سانتی گراد و 150 دور در دقیقه به مدت 14 تا 18 ساعت رشد می کند. . کشت تمام شده "یک شبه" یک سوسپانسیون کدر از سلول ها در محیط است. برای اجرای برخی کارها (به عنوان مثال، به دست آوردن سلول های شایسته یا بیان پروتئین های نوترکیب)، لازم است سلول ها تا مقادیر مشخصی OD600 (معمولاً 0.3-0.8) رشد کنند. در چنین مواردی لازم است تراکم نوری محصول در حال رشد نظارت شود تا لحظه دستیابی به تراکم نوری مورد نظر از دست نرود.

محیط جامد مواد مغذیدر مواقعی که نیاز به بدست آوردن کلنی های منفرد باشد از محیط غذایی جامد استفاده می شود E.coli. این معمولاً زمانی مورد نیاز است که سلول‌ها با مخلوط ناهمگن DNA پلاسمید (مثلاً در مورد مخلوط لیگاز) تبدیل می‌شوند و لازم است کلنی حاوی نوع صحیح پلاسمید پیدا شود. به طور معمول در مورد محیط رشد جامد E.coliاز لیوان های پلاستیکی یکبار مصرف با قطر 90 میلی متر استفاده کنید. رایج ترین محیط کشت جامد، آگار 1.5% است که روی LB (LB agar) تهیه می شود. برای تهیه 1 لیتر از چنین محیطی، 15 گرم آگار، 10 گرم تریپتون، 5 گرم عصاره مخمر و 10 گرم نمک طعام (یا 25 گرم از مخلوط LB آماده شده) باید در 1 لیتر آب مقطر حل شده و اتوکلاو شوند. . آگار باید تا دمای 50 تا 60 درجه سانتیگراد خنک شود، آنتی بیوتیک مورد نیاز را به آن اضافه کرده، در فنجان هایی با هر فنجان تقریباً 10 میلی لیتر ریخته و در زیر یک لامینار در کنار مشعل، با درب، بگذارید تا سفت شود. کمی باز شد هنگامی که تراکم تبخیر شد، می توان از فنجان برای تلقیح باکتری ها استفاده کرد.

درجه حرارت.با کاهش دما افزایش می یابد E.coliکند می شود، اما در برخی موارد E. coli در دماهای پایین تر برای چند روز رشد می کند، مانند زمانی که از یک کشت پخته می شود. E.coliسلول های شایسته یا بر اساس بیان پروتئین های نوترکیب.

هم زدن و هوادهی.برای اطمینان از هوادهی کافی، رشد کنید E.coliدر حالت تعلیق با هم زدن شدید (حداقل 150 دور در دقیقه) لازم است و ظرف (فلاسک یا لوله آزمایش پلاستیکی) باید حداکثر تا 1/10 حجم کل با محیط پر شود. برای بهبود هوادهی، درب لوله‌هایی که برای رشد باکتری‌ها استفاده می‌شوند، شل بسته می‌شوند و از فویل برای بستن فلاسک‌ها استفاده می‌شود. در برخی موارد از فلاسک هایی با تیغه های داخلی ویژه - "سپر" استفاده می شود. هنگام هم زدن در چنین فلاسک ها، سطح تماس بین محیط و هوا به دلیل پاشیدن مایع به میزان قابل توجهی افزایش می یابد. هر چه تعداد ضربه گیرها در فلاسک بیشتر باشد، پاشیدن مایع قوی تر و هوادهی بیشتر می شود. در صورت رشد E.coliدر یک محیط غذایی جامد، هوادهی به دلیل این واقعیت است که فضایی بین دیواره های ظرف باکتری و درب برای نفوذ هوا فراهم می شود.

آنتی بیوتیک هاهمانطور که در بالا ذکر شد، اکثر پلاسمیدها حاوی یک ژن مقاومت آنتی بیوتیکی هستند که در حضور آن سلول های حاوی پلاسمید از سلول هایی که آن را ندارند، انتخاب می شود. پرکاربردترین آنتی بیوتیک ها برای انتخاب عبارتند از: آمپی سیلین (غلظت کاری - 100 میکروگرم بر میلی لیتر)، کانامایسین (غلظت کاری - 30 میکروگرم در میلی لیتر)، و کلرامفنیکل (غلظت کاری - 25-30 میکروگرم بر میلی لیتر). آنتی بیوتیک ها معمولاً در اتانول یا آب حل می شوند (هر آنتی بیوتیک شرایط حلالیت خاص خود را دارد)، محلول های استوک هزار برابری تهیه و در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری می شوند. قبل از افزودن آنتی بیوتیک به آگار LB، لازم است آن را تا دمای 50 تا 60 درجه سانتیگراد خنک کنید، زیرا آنتی بیوتیک ها به راحتی در دماهای بالا از بین می روند. برخی از آنتی بیوتیک ها مانند آمپی سیلین به نور حساس هستند، بنابراین رشد باکتری ها در حضور آنها در تاریکی توصیه می شود.

از این محیط ها برای کشت و نگهداری سویه های نوترکیب استفاده می شود اشرشیاکلیو همچنین برای کشت معمول میکروارگانیسم های نه چندان سخت.

ترکیب**:

** ترکیب تأیید و تنظیم شده است تا پارامترهای مورد نیاز را برآورده کند

آماده سازی:

35.0 گرم پودر M557 یا 20.0 گرم پودر M575 یا 40.0 گرم پودر M1151 یا 25.0 گرم پودر M1245 را در 1000 میلی لیتر آب مقطر مخلوط کنید. حرارت دهید تا ذرات کاملا حل شوند. با اتوکلاو در دمای 1.1 اتمسفر (121 درجه سانتیگراد) به مدت 15 دقیقه استریل کنید. در ظروف مناسب بریزید.

اصل و ارزیابی نتیجه:

براث آگار و لوریا طبق دستور لنوکس (1) برای کشت و نگهداری سویه های نوترکیب تهیه می شوند. اشرشیاکلی. محیط های باقیمانده (2) از این نظر که غلظت آنها دو برابر کلرید سدیم است کمی متفاوت است. این محیط ها حاوی مواد مغذی کافی برای رشد سویه های نوترکیب هستند. چنین سویه هایی معمولاً مشتقات هستند اشرشیاکلی K12، کمبود سنتز ویتامین B. به دلیل این و سایر نشانگرهای اکسوتروفی که در طی جهش زایی به دست می آیند، سویه های نوترکیب ممکن است توانایی رشد در محیط های با ترکیب ضعیف را از دست بدهند.

هیدرولیز کازئین حضور پپتیدها در محیط را تضمین می کند، عصاره مخمر - ویتامین های B، کلرید سدیم - یون های سدیم برای انتقال غشا و حفظ فشار اسمزی مطلوب.

کنترل کیفیت:

ظاهر پودری:

پودر همگن با جریان آزاد زرد روشن.

چگالی محیط نهایی:

محیطی تشکیل می شود که از نظر چگالی با ژل آگار 1.5% (M557 یا M1151) مطابقت دارد.

رنگ و شفافیت محیط نهایی:

اگر ژل در لوله های آزمایش یا ظروف پتری تشکیل شود، محیط به رنگ زرد یا کهربایی، شفاف یا کمی مات است.

اسیدیته محیط:

در دمای 25 درجه سانتی گراد، محلول های آبی M557 (3.5 درصد وزنی در حجم) یا M575 (2.0 درصد وزنی بر حجم) دارای pH 0.2 ± 7.0 و محلول های آبی M1151 (4.0 درصد وزنی در حجم) یا M1245 (2.5 درصد) هستند. w/v) دارای pH 0.2 ± 7.5 است.

موضوع: جداسازی و تصفیه پروتئینpkb5

بخش تجربی

سویه ها و رسانه ها.

سویه استفاده شده در این کار E. coliB.L.21(DE3) pLysSبا پلاسمید pET32a:Pkb5 (شکل)، حاوی دامنه کاتالیزوری پروتئین کیناز بیفیدوباکتریوم لانگوم pkb5.

برای رشد سلول ها E. coliاز محیط های غذایی LB و TB استفاده شد.

جدول 1 - محیط های غذایی مورد استفاده برای کشت E. coli

محیط ها در اتوکلاو با فشار اضافی 0.8 اتمسفر به مدت 40 دقیقه استریل شدند.

برای حفظ فشار E. coliB.L.21(DE3) pLysSکه حاوی پلاسمید pET32a:Pkb5 بود، الک مونوکلونال روی ظروف پتری با محیط LB آگار با افزودن کلرامفنیکل (30 میکروگرم بر میلی لیتر) و آمپی سیلین (150 میکروگرم بر میلی لیتر) انجام شد.

برای تولید زیست توده سلولی E. coliB.L.21(DE3) pLysSحاوی پلاسمید pET32a:Pkb5، با افزودن کلرامفنیکل و آمپی سیلین در فلاسک روی محیط تلویزیون کشت داده شدند.

در مرحله اول، محصولات شبانه در محیط تلویزیون کشت شد. در مرحله دوم، 1.5 کشت شبانه به فلاسک ها با 150 میلی لیتر محیط تازه اضافه شد. رشد تحت شرایط هوادهی در 250 دور در دقیقه و دمای 37 درجه سانتیگراد تا چگالی نوری OD 600 = 0.6 (~ 2 ساعت) انجام شد، سپس بیان با افزودن IPTG (ایزوپروپیل - β-D-تیوگالاکتوزید) به یک نهایی القا شد. غلظت 0.5 میلی متر سپس، کشت در دمای 28 درجه سانتیگراد به مدت 18 ساعت انجام شد، پس از آن زیست توده با سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه در دور 6000 دور در دقیقه گلوله شد، با 1 مولار Tris-HCl (PH 7.6-8.0) شسته شد و در 20- درجه سانتیگراد منجمد شد.

برنج. طرح ساخت پلاسمید pET32a: Pkb5 .

تهیه لیزاتE .با اولی

سلول های ذوب شده E.بااولیدر دمای 4 0 C. سلول های ذوب شده از محیط رشد با 20 حجم (18 میلی لیتر) 1 مولار Tris-HCl، pH 7.8 شسته شدند. سلول ها با سانتریفیوژ با دور 7500 به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد گلوله شدند.وزن رسوب بر روی ترازوی تحلیلی 1.61 گرم تعیین شد و رسوبات در 10 حجم بافر لیز حاوی 300 میلی مولار KCl مجدداً معلق شدند. 50 میلی‌مولار KH 2 PO 4، 5 میلی‌مولار ایمیدازول، کوکتل مهارکننده اوره 6 مولار (کاملاً بدون EDTA، Roche Diagnostics Gmbh، آلمان). سلول ها با استفاده از یک تجزیه کننده اولتراسونیک SONICS VIBRA CELL 3 بار به مدت 59 ثانیه با فاصله زمانی 15 ثانیه در دامنه 40 درصد و دمای 4 درجه سانتیگراد لیز شدند. دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد مایع رویی بلافاصله قبل از اعمال در ستون جمع آوری و از طریق یک فیلتر (قطر منافذ 0.22 میکرومتر، Merck Millipore Ltd، آلمان) فیلتر شد.

کروماتوگرافی میل ترکیبی فلزی

روش کروماتوگرافی میل ترکیبی فلزی بر اساس برهمکنش غیرکووالانسی قطعه 6 هیستیدینی پروتئین نوترکیب (His-Tag) با یون های نیکل (Ni 2+) است که پیوندهای هماهنگی را با باقی مانده های اسید نیترواستیک تشکیل می دهد.

خالص سازی بر روی یک کلکتور کسری Bio Logic LP مدل 2110 (Bio Rad، ایالات متحده آمریکا) با استفاده از یک ستون IMAC Mini Profinity IMAC با مقیاس Bio-Scale انجام شد.

خالص سازی پروتئین بر اساس کتابچه راهنمای روش Profinite IMAC Resins (Bio Rad، ایالات متحده آمریکا) انجام شد.

قبل از شروع کار، سیستم با آب مقطر شسته شد، ستون Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges نصب شد و ستون با آب مقطر با سرعت 2 میلی لیتر در دقیقه شستشو شد. ستون با 8 حجم بافر لیز با سرعت 2 میلی لیتر در دقیقه متعادل شد، لیز در حجم 15 میلی لیتر با سرعت 0.5 میلی لیتر در دقیقه استفاده شد، با 15 حجم بافر لیز با سرعت 2 میلی لیتر شستشو شد. در دقیقه، سپس با 15 تا 3 حجم بافر شستشو با سرعت 2 میلی لیتر در دقیقه شستشو، شستشو با 15 حجم بافر شستشو با سرعت 2 میلی لیتر در دقیقه انجام شد. فراکسیون ها در حجم های 2 میلی لیتری جمع آوری شدند. فراکسیون مربوط به پروتئین شسته شده به طور جداگانه جمع آوری شد.

در پایان کار، ستون با 2 میلی لیتر آب مقطر با سرعت 2 میلی لیتر در دقیقه شسته و با 5 حجم 6 مولار گوانیدین-HCl و سپس با آب مقطر بازسازی شد. ستون مورد استفاده در اتانول 20 درصد در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد.

ترکیب محلول بافر

تعیین مقدار پروتئین

مقدار پروتئین با استفاده از روش برادفورد تعیین شد (Bradford M.M., 1976).

با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر دیجیتال PD-303، چگالی نوری در طول موج 595 نانومتر برای کسرهای 31 و 32 و مقدار پروتئین از نمودار (شکل) تعیین و غلظت محاسبه شد.

ترکیب رنگ: 100 میلی گرم CBB (Coomassie Brilliant Blue G-250)، 95٪ C 2 H 5 OH، 85٪ H 3 PO 4

برنج. نموداری برای تعیین مقدار نمونه آزمایشی با استفاده از روش بریدفورد

دیالیز مرحله‌ای

لوله های دیالیز مورد استفاده در این کار، لوله دیالیز پلیسه دار SnakeSkin (Thermo Scientific)، قطر منافذ 3500 MVCO بود.

فراکسیون های انتخاب شده در برابر یک محلول بافر حاوی 50 میلی مولار Tris-HCl، 5 میلی مولار β- مرکاپتواتانول، 10٪ گلیسرول، 3 مولار اوره در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 2.5 ساعت با هم زدن مداوم دیالیز شدند. در مرحله بعد، بافر دیالیز با بافر دیالیز حاوی 50 میلی مولار Tris-HCl، 5 میلی مولار β- مرکاپتواتانول، 10٪ گلیسرول، 1.5 مولار اوره، 2 میلی مولار MgCl2 جایگزین شد. یک شب با هم زدن مداوم در دمای 4 0 درجه سانتیگراد بگذارید.

جداسازی الکتروفورتیک پروتئین ها در ژل SDS-پلی آکریل آمید دناتوره کننده

الکتروفورز طبق روش Laemmli (Laemmli U. K., 1970) با استفاده از سیستم Mini proteam انجام شد. ژل پلی آکریل آمید 12 درصد در بافر حاوی 0.375 مولار Tris-HCl pH 8.8، 0.1 درصد SDS به عنوان ژل کار استفاده شد؛ ژل پلی آکریل آمید 3 درصد حاوی 0.125 مولار Tris-HCl pH 6.8 به عنوان ژل تشکیل دهنده استفاده شد. 0.1 درصد SDS. .

بافر الکترود 0.025 M Tris، 0.192 M گلیسین، 0.1% SDS بود.

قبل از کاربرد، نمونه ها در بافر حاوی 0.0625 مولار Tris-HCl pH 6.8، 2.3٪ SDS، 5٪ β-مرکاپتواتانول، 10٪ گلیسرول و 0.001٪ برم فنل بلو گرم شدند. الکتروفورز با ولتاژ ثابت 200 ولت انجام شد. در پایان الکتروفورز، PAGE به مدت 30 دقیقه در محلولی حاوی 50 درصد C2H5OH و 10 درصد CH3COOH تثبیت شد. سپس رنگ‌آمیزی در محلولی حاوی 0.2% SBB g-250، 40% C2H5 OH، 8% CH3COOH با حرارت دادن انجام شد. PAGE در 7% CH3COOH شسته شد.

تمرکز

برای اندازه گیری بیشتر فعالیت دامنه کاتالیزوری pkb 5، پروتئین شسته شده با استفاده از فیلترهای گریز از مرکز فوق العاده Amicon، قطر منافذ 50000 NMWL (Merck Millipore Ltd) تغلیظ شد.

تغلیظ نمونه پروتئین با استفاده از سانتریفیوژ اپندورف 5430 R در 7500 دور در دقیقه به مدت 1 ساعت و 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد انجام شد.

بررسی فعالیت

تعیین اتوفسفوریلاسیون pkb 5 (پروتئین نوترکیب) با استفاده از Kinase-Glo r Plus Luminiscent Kinase Assey (Promega V3772)، که برای اندازه گیری میزان فسفوریلاسیون توسط سطح ATP باقی مانده در طول واکنش استفاده می شود، انجام شد.

با استفاده از ایستگاه کاری خودکار Biomek 3000 Beckman Coulter©، 15 میکرولیتر محلول pkb 5 (5 میکروگرم و 1 میکروگرم در مخلوط واکنش) در بافر واکنش (15 میلی‌مولار HEPES pH 7.4؛ 20 میلی‌مولار NaCl، 10 میلی‌مولار MgCl 2، 0.5 mM MgCl2، 0.5 mM 0.02% Tween-20، 10 mg/ml BSA) و 15 میکرولیتر بافر واکنش (شاهد بدون پروتئین کیناز).

20 میکرومولار ATP (15 میکرولیتر) به هر چاه اضافه شد و محتویات چاه ها مخلوط شد. به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید و روی صفحه را با درب بپوشانید تا از تبخیر آن جلوگیری شود.

در پایان واکنش آنزیمی، 30 میکرولیتر از معرف برای تعیین لومینسانس به هر چاه اضافه شد، صفحه به مدت 40 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد و لومینسانس بر روی آشکارساز چند حالته Beckman Coulter © DTX 880 اندازه‌گیری شد.

بحث در مورد نتایج

در مرحله کروماتوگرافی میل ترکیبی فلز، از کروماتوگرام مشخص شد که پروتئین pkb 5 مورد مطالعه در فراکسیون های 31 و 32 وجود دارد.

شکل کروماتوگرام جداسازی حوزه کاتالیزوری pkb 5

فراکسیون های 31 و 32 ترکیب شدند زیرا حاوی پروتئین مورد مطالعه بودند.

از آنجایی که دامنه کاتالیزوری pkb5 تحت شرایط دناتوره جدا شد، لازم بود این پروتئین برای مطالعه بیشتر دوباره تا شود.

در مرحله بعد، فراکسیون های ادغام شده دیالیز شدند تا pkb5 از شرایط دناتوره به شرایط بومی باز شوند.

در مرحله بعد، برای بررسی شرایط بهینه برای خالص‌سازی کروماتوگرافی pkb5 فراکسیون‌های مختلف، جداسازی الکتروفورتیک پروتئین‌ها در ژل SDS-پلی آکریل آمید دناتوره‌کننده انجام شد.

برنج. الکتروفروگرام به دست آمده در نتیجه خالص سازی pkb5. الف) 1- لیز، 2- کسر 13-20، 3- کسر 26-27، 4- کسر 31، 5- نمونه آزمایشی پس از دیالیز، 6- پروتئین نشانگر (نشانگر وزن مولکولی پروتئین پیش رنگ شده، 20-120 کیلو دالتون). ب) 1- لیز، 2- فراکسیون 20-13، 3- فراکسیون 26-27، 4- کسر 31، 5- پروتئین نشانگر (نشانگر پروتئین پیش رنگ شده، محدوده وسیع، 7-175 کیلو دالتون)، 6- نمونه آزمایش پس از دیالیز

جدول (..) مقدار نهایی پروتئین اعمال شده برای الکتروفورز را نشان می دهد.

جدول(..)

در مرحله بعد پس از دیالیز گام به گام، غلظت پروتئین مورد مطالعه pkb 5 برای اندازه گیری بیشتر فعالیت افزایش یافت.

فعالیت فسفوترانسفراز دامنه کاتالیزوری pkb5 قبلا آزمایش شده بود. کارکنان آزمایشگاه ژنتیک میکروارگانیسم ها محقق ارشد، دکتری. Mavletova D. A. و محقق جوان Mironcheva T. A. IOGen im. N.I. Vavilova RAS اتوفسفوریلاسیون دامنه کاتالیزوری pkb5 را با استفاده از [γ-32P]-ATP انجام داد (شکل).

آ) ب)

برنج. الف) الکتروفروگرام اتوفسفوریلاسیون pkb5. ب) اتورادیوگرام اتوفسفوریلاسیون pkb5

بررسی فعالیت

معرف Kinase-Glo از مقدار باقیمانده ATP به عنوان بستری برای Ultra-Glo TM Luciferase استفاده می کند و تک اکسیژنه شدن لوسیفرین را برای تولید یک فوتون نور کاتالیز می کند (شکل 1). فعالیت پروتئین کیناز با شدت سیگنال لومینسانس نسبت معکوس دارد.

برنج. 1. طرح واکنش Kinase-Glo® Assey

بر اساس داده های شب تاب، نموداری از وابستگی درصد اتوفسفوریلاسیون به مقدار پروتئین کیناز pkb 5 ساخته شد. برنج.).

برنج. درصد اتوفسفوریلاسیون pkb 5

صاحبان پتنت RU 2303061:

این اختراع مربوط به بیوتکنولوژی است و می تواند برای کشت باکتری سودوموناس استفاده شود. محیط مغذی به عنوان منبع اسیدهای آمینه حاوی اتولیز مخمر مصرف شده نسل 7-8، K 2 HPO 4، MgSO 4 × 7H 2 O و آب لوله کشی است. این اختراع امکان افزایش بازده زیست توده باکتری های جنس Pseudomonas را فراهم می کند. 2 میز

محیط مغذی را می توان در بیوتکنولوژی برای کشت باکتری های جنس سودوموناس به منظور به دست آوردن محصولات بیولوژیکی بر اساس این میکروارگانیسم ها که دارای فعالیت آنتاگونیستی علیه پاتوژن های گیاهی قارچی هستند، استفاده کرد.

گونه های شناخته شده ای از باکتری ها از جنس Pseudomonas وجود دارد که فعالیت آنتاگونیستی نسبت به پاتوژن های گیاهی قارچی دارند و برای به دست آوردن دارو در برابر بیماری های گندم ناشی از فیتوپاتوژن های قارچی استفاده می شوند.

محیط غذایی LB شناخته شده است که یکی از اصلی ترین آنها برای کشت باکتری های جنس سودوموناس است - تولید کننده مواد با فعالیت قارچ کش و شامل g/l:

پپتون - 10

عصاره مخمر - 5

کلرید سدیم - 10

آب لوله کشی تا 1 لیتر.

نقطه ضعف محیط مغذی هزینه بالای آن است، زیرا حاوی یک جزء گران قیمت مانند پپتون است (تقریبا 700 روبل / کیلوگرم).

ماده مغذی شناخته شده King B، که به عنوان نمونه اولیه پذیرفته شده است، همچنین برای کشت باکتری های جنس Pseudomonas استفاده می شود. این شامل پپتون، گلیسیرین، نمک های معدنی مختلف، گرم در لیتر است:

پپتون - 20

گلیسیرین - 10

K 2 HPO 4 - 1.5

MgSO 4 7H 2 O - 1.5

آب مقطر تا 1 لیتر.

نقطه ضعف آن نیز هزینه بالای همراه با وجود چنین ماده گران قیمتی مانند پپتون در ترکیب آن است.

در تولید صنعتی محصولات بیولوژیکی بر پایه باکتری های جنس سودوموناس که برای استفاده در نباتات در نظر گرفته شده است، گرانی محیط غذایی ناگزیر منجر به افزایش قیمت محصول مورد نظر خواهد شد.

هدف فنی اختراع پیشنهادی کاهش هزینه محیط غذایی برای کشت باکتری های جنس سودوموناس و افزایش بازده زیست توده است.

وظیفه فنی بیان شده کاهش هزینه یک محیط غذایی برای کشت باکتری های جنس سودوموناس و افزایش عملکرد زیست توده با استفاده از یک محیط غذایی با ترکیب زیر، g/l حل می شود:

اتولیز مخمر آبجو مصرف شده 7-8 نسل (ماده خشک) - 26.8

K 2 HPO 4 - 1.5

MgSO 4 7H 2 O - 1.5

آب لوله کشی تا 1 لیتر.

مخمر آبجو مصرف شده نسل 7-8 در تولید آبجو استفاده نمی شود، زیرا سلول های چنین مخمری دیگر قادر به انجام عملکرد اصلی خود در طول فرآیند تخمیر نیستند. آنها همچنین توانایی خود را برای تولید مثل از دست می دهند. تعداد سلول های مرده در چنین نسلی به 89٪ می رسد، با فعالیت حیاتی ضعیف - تا 10٪. در حال حاضر، مخمر آبجو مصرف شده استفاده واجد شرایطی پیدا نمی کند و، به عنوان یک قاعده، در فاضلاب تخلیه می شود. در عین حال، مخمر آبجو مصرف شده حاوی مقادیر قابل توجهی ویتامین B، PP و E و همچنین تمام اسیدهای آمینه ضروری است.

کشت های میکروبی در طول کشت خود نسبت به ترکیب محیط غذایی بسیار حساس هستند. با انتخاب موفقیت آمیز همه اجزاء از نظر ترکیب کیفی و کمی، به ویژه مجموعه ای از اسیدهای آمینه، محیط رشد و توسعه نسبتاً سریع جمعیت میکروارگانیسم ها را تضمین می کند و متعادل در نظر گرفته می شود. در پروتئین سلولی، اسیدهای آمینه منفرد 1 تا 5 درصد از کل پروتئین را تشکیل می دهند، که از آن مقدار اسیدهای آمینه مورد نیاز به عنوان فاکتورهای رشد را می توان تقریباً تخمین زد. استثنا گلوتامیک اسید و گلوتامین است که از نظر کمی نقش زیادی در متابولیسم اسیدهای آمینه ایفا می کنند و محتوای آنها در محیط باید به طور قابل توجهی از محتوای اسیدهای آمینه دیگر بیشتر باشد. جدول 1 ترکیب اسید آمینه تعیین شده توسط ما از مخمر آبجو مصرف شده از تولید کنندگان مختلف آبجو، و همچنین نمونه ای از پپتون تجاری را نشان می دهد که برای استفاده در برخی از مواد مغذی در میکروبیولوژی در نظر گرفته شده است.

همانطور که از داده های جدول 1 نشان می دهد، مخمر آبجو مصرف شده حاوی اسید گلوتامیک به میزان قابل توجهی است و محتوای آن بر حسب درصد بیشتر از پپتون است. همچنین لازم به ذکر است که محتوای تمام اسیدهای آمینه ضروری بیشتر از پپتون است که نشان دهنده ترکیب اسید آمینه متعادل تر جزء پیشنهادی ماده مغذی است.

محیط غذایی پیشنهادی به شرح زیر تهیه می شود.

برای به دست آوردن اتولیز، مخمر آبجو مصرف شده نسل 7-8 به مدت یک ساعت تحت عملیات حرارتی در 100 درجه سانتیگراد قرار می گیرد.

اجزای معدنی به اتولیز مخمر اضافه می شود، حجم مخلوط حاصل با آب لوله کشی به 1 لیتر تنظیم می شود و اتوکلاو می شود. تلقیح اضافه می شود (40 میلی لیتر کشت باکتری سودوموناس). سویه به مدت 48 ساعت در دمای 30-28 درجه سانتی گراد با هوادهی ثابت رشد می کند. سپس تیتر در مایع کشت با روش رقت شناخته شده تعیین می شود.

مثال 1. یک محیط غذایی از ترکیب زیر تهیه می شود. به 26.8 گرم اتولیز مخمر 1.5 گرم K 2 HPO 4 و 1.5 گرم MgSO 4 · 7H 2 O اضافه کنید، حجم مخلوط حاصل را با آب لوله کشی و اتوکلاو به 1 لیتر برسانید. سپس 40 میلی لیتر از کشت باکتری Pseudomonas aureofaciens IB 51 به محیط غذایی تلقیح می شود. تخمیر به مدت 48 ساعت در دمای 30-28 درجه سانتیگراد با هوادهی ثابت انجام می شود. تیتر مایع کشت در پایان تخمیر 5·10 11 CFU/ml است.

تحت شرایط مشابه، سویه Pseudomonas aureofaciens IB 51 بر روی محیط شناخته شده King V کشت می شود. تعداد میکروارگانیسم ها در پایان فرآیند کشت 3·10 10 CFU/ml بود.

مثال 2. محیط غذایی مطابق با مثال 1 همانطور که در بالا توضیح داده شد تهیه می شود و 40 میلی لیتر از کشت سودوموناس پوتیدا IB 17 تلقیح می شود. تخمیر به روشی مشابه مطابق با مثال 1 انجام می شود. تیتر مایع کشت در پایان تخمیر 5·10 11 CFU/ml است.

تحت شرایط مشابه، سویه Pseudomonas putida IB 17 بر روی محیط کشت شناخته شده King V کشت می شود. تعداد میکروارگانیسم ها در پایان فرآیند کشت 6·10 10 CFU/ml بود.

جدول 2 نتایج کشت باکتری های جنس Pseudomonas روی محیط کشت King B (طبق نمونه اولیه) و محیط پیشنهادی را نشان می دهد. همانطور که مشاهده می شود، بالاترین تیتر باکتری از جنس سودوموناس در نمونه هایی نگهداری می شود که محیط غذایی به جای پپتون و گلیسرول حاوی اتولیز مخمر آبجو مصرف شده نسل 7-8 است.

مثال 3. آزمایش حفظ فعالیت آنتاگونیستی سویه IB 51 سودوموناس اوروفاسینس رشد یافته در محیط پیشنهادی.

سوسپانسیونی از اسپورهای پاتوژن گیاهی قارچی (Bipolaris sorokiniana). سپس باکتری‌های سودوموناس اورئوفاسینس سویه IB 51 که در محیط پیشنهادی رشد کرده‌اند، با تزریق در همان صفحات کاشته می‌شوند. ظروف در دمای 28 درجه سانتیگراد به مدت 3 روز انکوبه می شوند.

محاسبه فعالیت آنتاگونیستی با قطر متوسط ​​منطقه غیبت یا سرکوب رشد قارچ آزمایشی در اطراف کلنی سویه انجام می شود. برای Bipolaris sorokiniana 55 میلی متر بود.

تحت شرایط مشابه، فعالیت آنتاگونیستی سویه IB 51 Pseudomonas aureofaciens که بر روی محیط شناخته شده King V کشت می شود، در نظر گرفته می شود.میانگین قطر ناحیه سرکوب رشد قارچ 55 میلی متر بود.

مثال 4. بررسی حفظ و در نظر گرفتن فعالیت آنتاگونیستی سویه Pseudomonas putida IB 17، رشد یافته در محیط پیشنهادی، به روشی که در بالا توضیح داده شد مطابق با مثال 3 انجام می شود. قطر متوسط ​​منطقه سرکوب رشد قارچ آزمایشی 22 میلی متر بود.

تحت شرایط مشابه، فعالیت آنتاگونیستی سویه Pseudomonas putida IB 17 که روی محیط معروف King V کشت می‌شود، در نظر گرفته می‌شود. متوسط ​​قطر منطقه سرکوب رشد قارچ 22 میلی‌متر بود.

نتایج در جدول 2 نشان داده شده است و نشان دهنده حفظ اثر آنتاگونیستی سویه های باکتری از جنس سودوموناس است که در محیط پیشنهادی روی کشت آزمایشی قارچ گیاهی بیماریزا Bipolaris sorokiniana رشد کرده اند.

بنابراین، استفاده از محیط غذایی پیشنهادی حاوی اتولیزات مخمر آبجو مصرف شده نسل هفتم تا هشتم به عنوان منبع اسیدهای آمینه برای کشت باکتری‌های جنس سودوموناس که فعالیت آنتاگونیستی نسبت به پاتوژن‌های گیاهی قارچی دارند، می‌تواند هزینه را به میزان قابل توجهی کاهش دهد. محصولات بیولوژیکی مبتنی بر این میکروارگانیسم ها و افزایش بازده زیست توده است.

ادبیات

1. اختراع RF 2203945, 7 С12N 1/20, А01N 63/00 // (С12N 1/20, С12R 1:38). سویه ای از باکتری Pseudomonas aureofaciens برای به دست آوردن دارویی در برابر بیماری های گندم ناشی از پاتوژن های گیاهی قارچی. / Loginov O.N.، Sveshnikova E.V.، Silishchev N.N.، Melentyev A.I.، Galimzyanova N.F.، Boyko T.F. اعلام شده در تاریخ 1380/08/17; انتشارات 05/10/2003. بولتن 13.

2. حق اختراع RF 2213774, 7 С12N 1/20 // (С12N 1/20, С12R 1:40). سویه ای از باکتری سودوموناس پوتیدا برای به دست آوردن دارویی در برابر بیماری های گندم ناشی از پاتوژن های گیاهی قارچی. / Loginov O.N.، Sveshnikova E.V.، Silishchev N.N.، Melentyev A.I.، Galimzyanova N.F.، Boyko T.F.، Isaev R.F. اعلام شده در 2002/03/25; انتشارات 10.10.2003. بولتن 28.

3. اختراع RF 2130265, 6 A01N 63/00 // (A01C 1/00). روشی برای مبارزه با پاتوژن های گیاهی / Dashkevich V.S., Dashkevich N.Yu., Ashmarina L.F., Shusharo A.I., اعلام شده 97/12/29; انتشارات 99/05/20. بولتن 14.

4. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. دو محیط ساده برای نشان دادن پیوسیانین و فلورسین. //J.Lab. کلین. پزشکی - 1954. - V.44. - ص301-307.

5. Smirnov V.V., Kiprianova E.A. باکتری از جنس Pseudomonas. کیف، "Naukova Dumka"، 1990. - P.222.

6. گورویچ یو.ال. ثبات و تنظیم تولید مثل در جمعیت های میکروبی. - Novosibirsk, Science, 1984. - P.28-29.

7. Manakov M.N., Pobedimsky D.G. مبانی نظری تولید میکروبیولوژیک. - م.: آگروپرومزدات، 1990. - ص 180-181.

8. پرث اس.جی. مبانی پرورش میکروارگانیسم ها و سلول ها. م.: میر، 1357. - ص 147-148.

9. Tepper E.Z., Shilnikova V.K., Pereverzeva G.I. کارگاه میکروبیولوژی. - م.: بوستارد، 2004. - 256 ص.

میز 1
ترکیب اسید آمینه پپتون و مخمر مصرف شده از آبجوسازی های مختلف
	مخمر مصرف شده (اوفا، افس)	مخمر مصرف شده (Sterlitamak، Shikhan-Heineken)	مخمر مصرف شده (Novotroitsk، PIT)	پپتون
ترئونین	5,56%	5,45%	5,25%	2,09%
والین	4,67%	4,34%	5,34%	2,22%
متیونین	1,83%	1,85%	2,00%	0,96%
ایزولوسین	5,22%	4,50%	5,30%	1,81%
لوسین	6,93%	6,31%	7,03%	2,98%
تیروزین	4,28%	3,72%	4,44%	0,78%
فنیل آلانین	4,97%	4,86%	5,37%	2,34%
لیزین	11,07%	10,57%	11,71%	4,85%
سیستین	1,24%	1,72%	1,55%	0,23%
سرین	5,35%	5,86%	5,87%	3,50%
اسید گلوتامیک	15,20%	13,70%	13,40%	11,35%
پرولین	5,40%	6,23%	4,87%	14,46%
گلیسین	5,78%	5,33%	5,36%	27,33%
آلانین	8,37%	7,42%	7,80%	8,97%
هیستیدین	3,34%	2,00%	3,47%	0,75%
آرژنین	0,79%	6,54%	1,09%	9,52%
آسپارتیک اسد	10,00%	9,60%	10,15%	5,86%

محیط غذایی برای کشت باکتری های جنس سودوموناس که برای تولید داروهای ضد قارچی استفاده می شود، حاوی منبع اسیدهای آمینه K 2 HPO 4، MgSO 4 · 7H 2 O و آب است که به عنوان منبع اسیدهای آمینه مشخص می شود. حاوی اتولیزات مخمر آبجو مصرف شده نسل 7-8 و آب لوله کشی با نسبت اجزای زیر، گرم در لیتر:

اختراعات مشابه:

این اختراع مربوط به پزشکی، به ویژه اپیدمیولوژی و میکروبیولوژی است، و می تواند در نظارت اپیدمیولوژیک عفونت های چرکی-عفونی برای شناسایی انجمن های میکروبی بیمارستان استفاده شود.

این اختراع مربوط به بیوتکنولوژی، یعنی مجتمع‌های فعال بیولوژیکی، آماده‌سازی برای پزشکی، کشاورزی و صنایع غذایی است و می‌تواند برای تهیه آماده‌سازی‌های درمانی و پیشگیرانه بر اساس لاکتو و بیفیدوباکتری‌های زنده استفاده شود.