Размножение E.coli в питательных средах и его факторы. Питательная среда для культивирования бактерий рода pseudomonas Плотность готовой среды

Размножение E.coli в стандартных условиях может быть описано кривой, которая представляет собой зависимость количества клеток E.coli в суспензии от времени роста (см. рис в презентации). Количество клеток E.coli в суспензии эквивалентно оптической плотности культуры E.coli, измеренной при 600 нм («мутность суспензии»). Кривая размножения E.coli включает в себя 4 основные фазы: (начальная фаза, lag-phase), экспоненциальная фаза (exponential, log-phase), стационарная фаза (stationary phase) и фаза смерти (death phase). В процессе начальной фазы роста, увеличение клеточной биомассы происходит очень медленно. Это связано с исходно небольшим количеством клеток. Когда оптическая плотность суспензии достигает приблизительно значения 0.1, рост E. coli переходит в экспоненциальную фазу – фазу быстрого роста. Установлено, что во время экспоненциальной фазы оптическая плотность культуры увеличивается в среднем в два раза через каждые 30 минут. Когда оптическая плотность суспензии становится равной примерно 1.5, из-за большого количества клеток и небольшого количества питательных веществ в среде рост E.coli существенно замедляется и переходит в стационарную фазу. И, наконец, избыточно большое количество клеток в суспензии, практически полное истощение питательной среды и высокая концентрация в ней метаболитов бактерий приводит к гибели бактериальных клеток, их лизису и снижению плотности бактериальной культуры (фаза смерти).

Стандартными условиями роста E.coli в суспензии являются следующие параметры: питательная среда LB-broth, температура 37 C, интенсивное перемешивание (не менее 150 об/мин) и достаточная аэрация. Следует заметить, что рост E.coli возможен не только в суспензии, но и на так называемых твердых питательных средах, содержащих агар. В этом случае интенсивное перемешивание не требуется.

Питательные среды для роста E.coli .

Жидкие питательные среды . Как уже упоминалось выше, наиболее широко используемой средой для роста E.coli в суспензии является среда LB-broth (Luria Bertani medium, lysogeny broth). Эта высокопитательная среда и ее основными компонентами являются триптон или пептон, дрожжевой экстракт и NaCl. Триптон (пептон) являются продуктами гидролиза казеина под действием трипсина (пепсина) и служат источниками аминокислот и пептидов. Дрожжевой экстракт является источником углерода, витаминов (в том числе группы B), а также минеральных веществ, таких, как ионы магния, серы, кальция; а NaCl – обеспечивает бактериальные клетки ионами Na + для реализации эффективного транспорта и поддержания осмотического баланса. Чтобы приготовить среду LB, необходимо растворить 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г NaCl (или 25 г готовой смеси) в 1 л воды, проавтоклавировать и остудить. Следует заметить, что рост различных штаммов E.coli в среде LB происходит с различной скоростью и некоторые штаммы очень чувствительны к высокому содержанию NaCl. Известно, что NaCl в 10% концентрации может оказывать ингибирующее действие на рост некоторых штаммов E.coli. В связи с этим, были разработаны протоколы средне-солевой среды LB (5 г NaCl/л LB) и низкосолевой среды LB (0.5 г NaCl/л) при идентичном содержании пептона и дрожжевого экстракта. Низкосолевой вариант среды LB также используется в том случае, если в среду роста планируется добавлять антибиотик, чувствительный к высоким концентрациям соли. pH среды LB без дополнительного доведения равняется приблизительно 7.0 – 7.2.

В норме для достижения стационарной фазы растить E.coli следует 14-18 часов, однако, иногда возникают ситуации, когда требуется растить E.coli в течение нескольких суток (например, для наработки больших количеств биомассы при экспрессии белка). В таком случае, использование среды LB не эффективно, так как происходит истощение питательных веществ и понижение pH среды, вызванное высокой концентрацией метаболитов, что инициирует гибель клеток и ингибирует их рост. В таких случаях для роста E.coli используют другие среды, содержащие дополнительные питательные вещества и буферные системы для поддержания pH. Для увеличения питательных веществ большинство таких сред содержат двукратное или трехкратное количество триптона и дрожжевого экстракта. Кроме этого, в состав некоторых сред входят: глицерол или глюкоза в качестве дополнительных источников углерода (среды TB, SOC), фосфатная буферная система или СаСО 3 , препятствующие закислению среды и поддерживающие ее pH в стационарной фазе роста E.coli (среда TB), а также соли Mg 2+ и K + (среды 2*YT, SOB, SOC).

Для роста E.coli в жидких питательных средах обычно используют предварительно стерилизованные или обработанные спиртом конические стеклянные колбы или 50 мл пластиковые пробирки Falcon. Наращивание биомассы E.coli для последующего выделения плазмидной ДНК обычно проводят в течение ночи, т. е. получают «ночную» культуру. Для этого в колбу или пластиковую пробирку со средой в присутствии необходимого антибиотика помещают небольшое количество предварительно трансформированных плазмидой бактерий и выращивают культуру при 37°С и 150 об/мин в течение 14 –18 часов. Готовая «ночная» культура представляет собой мутную суспензию клеток в среде. Для реализации некоторых задач (например, получения компетентных клеток или экспрессии рекомбинантных белков) требуется доращивать клетки до определенных значений OD600 (обычно 0.3 – 0.8). В таких случаях необходимо осуществлять мониторинг оптической плотности растущей культуры, чтобы не пропустить момент достижения нужной оптической плотности.

Твердые питательные среды. Твердая питательная среда используется в том случае, когда необходимо получить единичные колонии E.coli . Обычно это требуется, когда клетки трансформируют гетерогенной смесью плазмидных ДНК (например, в случае лигазной смеси) и необходимо найти колонию, содержащую правильный вариант плазмиды. Обычно в случае твердых питательных сред для роста E.coli используют одноразовые пластиковые чашки диаметром 90 мм. Наиболее распространенной твердой питательной средой является 1.5 % агар, приготовленный на LB (LB-агар). Для приготовления 1 л такой среды 15 г агара, 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г NaCl (или 25 г готовой смеси LB) необходимо растворить в 1 л дистиллированной воды и проавтоклавировать. Агар следует остудить до температуры 50°C - 60°С, добавить в него необходимый антибиотик, разлить по чашкам приблизительно по 10 мл на чашку и оставить застывать под ламинаром рядом с горелкой, приоткрыв крышку. Когда конденсат испарится, чашку можно использовать для посева бактерий.

Температура. С понижением температуры рост E.coli замедляется, однако в некоторых случаях E.coli растят при более низких температурах в течение нескольких дней, как, например, при приготовлении из культуры E.coli компетентных клеток или при экспрессии рекомбинантных белков.

Перемешивание и аэрация. Для обеспечения достаточной аэрации растить E.coli в суспензии необходимо при интенсивном перемешивании (не менее 150 об/мин), а сосуд (колба или пластиковая пробирка) должны быть заполнены средой максимум на 1/10 от общего объема. Для улучшения аэрации крышки пробирок, используемые для роста бактериальной культуры закрывают неплотно, а для закрытия колб используют фольгу. В некоторых случаях используют колбы со специальными внутренними лопастями -«отбойниками». При перемешивании в таких колбах поверхность соприкосновения среды с воздухом заметно увеличивается благодаря разбрызгиванию жидкости. Чем больше отбойников в колбе, тем сильнее разбрызгивание жидкости и выше аэрация. В случае роста E.coli на твердой питательной среде аэрация происходит благодаря тому, что между стенками бактериальной чашки и крышкой предусмотрено некоторое пространство для проникновения воздуха.

Антибиотики Как уже упоминалось выше, большинство плазмид содержат ген устойчивости к антибиотику, в присутствие которого происходит отбор клеток, содержащих плазмиду от клеток, ее не содержащих. Наиболее широко используемыми для селекции антибиотиками являются ампициллин (рабочая концентрация – 100 мкг/мл), канамицин, (рабочая концентрация – 30 мкг/мл), и хлорамфеникол (рабочая концентрация – 25-30 мкг/мл). Антибиотики обычно растворяют в этаноле или в воде (для каждого антибиотика условия растворимости свои), готовят тысячекратные стоковые растворы и хранят при -20°C. Перед добавлением антибиотиков в LB-агар необходимо его остудить до 50-60°C, т.к антибиотики легко разрушаются при высоких температурах. Некоторые антибиотики, например, ампициллин, светочувствительны, поэтому рост бактерий в их присутствие желательно проводить в темноте.

Эти среды используют для культивирования и хранения рекомбинантных штаммов Escherichia coli , а также для обычного культивирования не очень прихотливых микроорганизмов.

Состав**:

** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам

Приготовление:

Размешать 35,0 г порошка М557 или 20,0 г порошка М575 или 40,0 г порошка М1151 или 25,0 г порошка М1245 в 1000 мл дистиллированной воды. Подогреть для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Разлить в соответствующие емкости.

Принцип и оценка результата:

Агар и бульон Луриа готовят по прописи Lennox (1) для культивирования и хранения рекомбинантных штаммов Escherichia coli . Остальные среды (2) слегка отличаются тем, что у них двойная концентрация хлорида натрия. Эти среды имеют достаточное количество питательных веществ для роста рекомбинантных штаммов. Такие штаммы обычно являются производными Escherichia coli К12, дефицитного по синтезу витамина группы В. Из-за этого и других маркеров ауксотрофности, полученных в ходе мутагенеза, рекомбинантные штаммы могут утрачивать способность к росту на средах обедненного состава.

Гидролизат казеина обеспечивает присутствие в среде пептидов, дрожжевой экстракт - витаминов группы В, хлорид натрия - ионов натрия для мембранного транспорта и поддержания оптимального осмотического давления.

Контроль качества:

Внешний вид порошка:

Гомогенный сыпучий светло-желтый порошок.

Плотность готовой среды:

Образуется среда, соответствующая по плотности 1,5%-ному агаровому гелю (М557 или М1151).

Цвет и прозрачность готовой среды:

Среда имеет желтую или янтарную окраску, прозрачна или слегка опалесцирует, если в пробирках или чашках Петри формируется гель.

Кислотность среды:

При 25°С водные растворы М557 (3,5% вес/об) или М575 (2,0% вес/об) имеют рН 7,0 ± 0,2, а водные растворы М1151 (4,0% вес/об) или М1245 (2,5% вес/об) имеют рН 7,5 ± 0,2.

Тема: Выделение и очистка белка pkb 5

Экспериментальная часть

Штаммы и среды.

В работе использовали штамм E . coli BL 21(DE 3) pLysS , с плазмидой pET32a:Pkb5 (рис), содержащей каталитический домен протеинкиназы pkb5 Bifidobacterium longum.

Для выращивания клеток E . coli использовали питательные среды LB и TB.

Таблица 1-Питательные среды, использованные для выращивания E . coli

Среды стерилизовали в автоклаве при избыточном давлении 0,8 ати в течение 40 минут.

Для поддержания штамма E . coli BL 21(DE 3) pLysS , содержащего плазмиду pET32a:Pkb5, проводили моноклоновый рассев на чашках Петри с агаризованной средой LB с добавлением хлорамфеникола(30 мкг/мл) и ампициллина (150 мкг/мл).

Для наработки биомассы клетки E . coli BL 21(DE 3) pLysS , содержащие плазмиду pET32a:Pkb5, выращивали в колбах на среде ТВ с добавлением хлорамфеникола и ампициллина.

На первом этапе выращивали ночные культуры на среде ТВ. На втором этапе в колбы с 150 мл свежей среды вносили по 1,5 ночной культуры. Выращивание проводили в аэрируемых условиях при 250 об/мин и температуре 37 0 С до оптической плотности OD 600 = 0,6 (~2 часа), затем индуцировали экспрессию добавлением ИПТГ (изопропил - β-D-тиогалактозид) до конечной концентрации 0,5 мМ. Далее проводили культивирование при 28 0 С в течение 18 часов, после чего биомассу осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 6 000 об/мин, промывали 1M Tris-HCl (pH 7,6-8,0) и замораживали при -20 0 С.

Рис. Схема конструкции плазмиды pET32a: Pkb 5 .

Приготовление лизата E .с oli

Размораживали клетки E .с oli при температуре 4 0 С. Размороженные клетки отмывали от ростовой среды с 20-ю объемами (18 мл) 1М Тris-HCl, рН 7,8. Клетки осаждали центрифугированием 7500 об/мин в течение 10 мин при температуре 4 0 С. На аналитических весах определяли вес осадка 1,61 г.. Осадки ресуспендировали в 10-ти объемах лизирующего буфера, содержащего 300 мМ КCl, 50 мМ КH 2 PO 4 , 5 мМ Имидазола, 6 М мочевины ингибиторный коктейль (complete EDTA-free, Roche Diagnostics Gmbh, Germany). Клетки лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора SONICS VIBRA CELL 3 раза по 59 секунд с интервалом 15 секунд при амплитуде 40 % и температуре 4 0 С. Для осаждения обломков клеточных стенок, лизат центрифугировали при 10000 об/мин в течение 20 мин при температуре 4 0 С. Надосадочную жидкость отбирали и фильтровали через фильтр (диаметр пор- 0,22 мкм, Merck Millipore Ltd, Germany) непосредственно перед нанесением на колонку.

Металл-аффинная хроматография

Метод металл-аффинной хроматографии основана на не ковалентном взаимодействии 6 гистидинового фрагмента рекомбинантного белка (His-Tag) с ионами никеля (Ni 2+), образующими координационные связи с остатками нитролиуксусной кислоты.

Очистку проводили на приборе Bio Logic LP Model 2110 Fraction Collector (Bio Rad, USA) используя колонку объемом 1 мл Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges.

Очистку белка проводили согласно методическому руководству Profinite IMAC Resins (Bio Rad, USA).

Перед началом работы промывали систему дистиллированной водой, устанавливали колонку Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges, колонку промывали дистиллированной водой со скоростью 2 мл/мин. Уравновешивали колонку с 8-ю объемами лизирующего буфера со скоростью 2 мл/мин, наносили лизат в объеме 15 мл со скоростью 0,5 мл/мин, промывали с 15-ю объемами лизирующего буфера со скоростью 2 мл/мин, далее промывали с15-ю объемами промывочного буфера со скоростью 2 мл/мин, элюцию проводили с 15-ю объемами элюирующего буфера со скоростью 2 мл/мин. Фракции собирали по 2 мл. Фракции соотвествующие элюируемому белку собирали отдельно.

По окончании работы колонку промывали 2 мл дистиллированной воды со скоростью 2 мл/мин и регенерировали с 5-ю объемами 6 М гуанидин-HCl и далее дистиллированной водой. Использованную колонку хранили в 20% этаноле при температуре 4 0 С.

Состав буферного раствора

Определение количества белка

Количества белка определили по методу Брэдфорд (Bradford M.M. , 1976).

На цифровом спектрофотометре PD-303 для фракций 31 и 32 определяли оптическую плотность при длине волны 595 нм и по графику (рис) определяли количество белка и рассчитывали концентрацию.

Состав краски: 100 мг CBB (Coomassie Brilliant Blue G-250), 95% C 2 H 5 OH, 85 % H 3 PO 4

Рис. График для определения количества исследуемого образца по методу Бреэдфорд

Ступенчатый диализ

В работе использовались диализные трубки SnakeSkin Pleated Dialysis Tubing (фирма Thermo scientific), диаметр пор- 3,500 MVCO.

Отобранные фракции диализовали против буферного раствора, содержащего 50 мМ Tris-HCl, 5 мМ β-меркаптоэтанол, 10 % глицерин, 3 М мочевины при температуре 4 0 С в течение 2,5 часа при постоянном перемешивание. Далее диализный буфер заменяли на диализный буфер содержащий 50 мМ Tris-HCl, 5 мМ β-меркаптоэтанол, 10 % глицерин, 1,5 М мочевины, 2 мМ МgCl 2 . Оставляли на ночь при постоянном перемешивание при 4 0 С.

Электрофоретическое разделение белков в денатурирующем ДСН- полиакриламидном геле

Электрофорез проводили по методу Лэммли (Laemmli U. K.,1970) с использованием Mini proteam sistem. В качестве рабочего геля использовали 12 % полиакриламидный гель в буфере, содержащем 0,375 М Tris-HCl рН 8,8, 0,1 % SDS, в качестве формирующего геля использовали 3 % полиакриламидный гель содержащей, 0,125 М Tris-HCl рН 6,8, 0,1 % SDS.

В качестве электродного буфера использовался 0,025 М Трис, 0,192 М глицин, 0,1 % SDS.

Перед нанесением образцы прогревали в буфере,содержащем 0,0625 М Tris-HCl рН 6,8, 2,3 % SDS, 5 % β-меркаптоэтанол, 10 % глицерин и 0,001 % бром феноловый синий. Электрофорез вели при постоянном напряжение 200 вольт. По окончании электрофореза ПААГ фиксировали в течение 30 мин в растворе, содержащем 50 % C 2 H 5 OH и 10 % СH 3 COOH. Далее окрашивание проводили в растворе содержащая 0,2 % СВВ g-250, 40% C 2 H 5 OH, 8 % СH 3 COOH при нагревание. ПААГ отмывали в 7 % СH 3 COOH.

Концентрирование

Для дальнейшего измерения активности каталитического домена pkb 5 проводилось концентрирование элюированного белка при помощи центрифужных концентраторов Amicon Ultra Centrifugal Filters, диаметр пор-50,000 NMWL (Merck Millipore Ltd).

Концентрирование белкового образца проводили при помощи центрифугирования Eppendorf 5430 R при 7500 об/мин в течение 1 час 20 мин при температуре 4 0 С.

Проверка активности

Определение автофосфорилирования pkb 5 (рекомбинантный белок) проводился с помощью Kinase-Glo r Plus Luminiscent Kinase Assey (Promega V3772), используемого для измерения степени фосфорилирования по уровню АТФ, оставшегося в ходе реакции.

В лунки 96-луночного планшета, используя автоматизированную рабочую станцию Biomek 3000 Beckman Coulter©, вносили 15 мкл раствора pkb 5 (5 мкг и 1 мкг в реакционной смеси) в реакционном буфере (15 мМ HEPES pH 7,4; 20 мМ NaCl, 10 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ EDTA, 0,02% Tween-20, 10 мг/мл BSA) и 15 мкл реакционного буфера (контроль без протеинкиназы).

В каждую лунку добавляли 20 мкМ АТФ 15 мкл, перемешали содержимое лунок. Инкубировали при комнатной температуре 30 мин, закрыв планшет крышкой для предотвращения испарения.

По окончании ферментативной реакции добавляли в каждую лунку по 30 мкл реагента для определения люминесценции, инкубировали планшет 40 мин при комнатной температуре, измерили люминесценцию на приборе Beckman Coulter© DTX 880 Multimode Detector.

Обсуждение результатов

На стадии металл-аффинной хроматографии по хроматограмме определяли, что исследуемый белок pkb 5 содержится в фракциях 31 и 32.

Рис..Хроматограмма выделения каталитического домена pkb 5

Фракции 31 и 32 объединяли, так как в них содержиться исследуемый белок.

Так как каталитический домен pkb5 выделялся в денатурирующих условиях, для дальнейшего исследования было необходимо провести рефолдинг этого белка.

На следующем этапе объедененные фракции диализовали для рефолдинга pkb5 из денатурирующих условий в нативные условия.

На следующей стадии для проверки оптимальных условий хроматографической очистки pkb5 различных фракций, провели электрофоретическое разделение белков в денатурирующем SDS- полиакриламидном геле.

Рис. Электрофореграмма полученная в результате очистки pkb5; а) 1- лизат, 2- фракции 13-20, 3- фракции 26-27, 4- фракция 31, 5- исследуемый образец после диализа, 6- маркерные белки (Prestained Protein Molecular Weight Marker, 20-120 kDa); б) 1- лизат, 2- фракции 13-20, 3- фракции 26-27, 4- фракция 31, 5- маркерные белки (Prestained Protein Marker, Broad Range, 7-175 kDa), 6- исследуемый образец после диализа

В таблице (..) указано конечное количество белков наносимое на электрофорез.

Таблица(..)

На следующем этапе после ступенчатого диализа увеличивали концентрацию исследуемого белка pkb 5 для дальнейшего измерения активности.

Ранее была проведена проверка фосфотрансферазной активности каталитического домена pkb5. Сотрудниками лаборатории генетики микроорганизмов с.н.с., к.т.н. Мавлетовой Д. А. и м.н.с. Мирончевой Т. А. ИОГен им. Н. И. Вавилова Ран было проведено автофосфорилирование каталитического домена pkb5 с использованием [γ-32P]-ATP (рис).

а) б)

Рис. а) Электрофореграмма автофосфорилирования pkb5. б) Авторадиограмма автофосфорилирования pkb5

Проверка активности

Реагент Kinase-Glo использует остаточное количество АТФ как субстрат для Ultra-Glo TM Luciferase, катализируя монооксигенацию люциферина, с образованием фотона света (рис. 1). Активность протеинкиназы обратно пропорциональна интенсивности сигнала люминесценции.

Рис. 1 . Схема реакции Kinase-Glo® Assey

По люминесцентным данным построен график зависимости процента автофосфорилирования от количества протеинкиназы pkb 5 (рис. ).

Рис. Процент автофосфорилирования pkb 5

Владельцы патента RU 2303061:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при культивировании бактерий Pseudomonas. Питательная среда содержит в качестве источника аминокислот автолизат отработанных дрожжей 7-8 генерации, К 2 НРО 4 , MgSO 4 ×7Н 2 О и водопроводную воду. Изобретение позволяет увеличить выход биомассы бактерий рода Pseudomonas. 2 табл.

Питательная среда может быть использована в биотехнологии при культивировании бактерий рода Pseudomonas с целью получения биопрепаратов на основе этих микроорганизмов, обладающих антагонистической активностью по отношению к грибным фитопатогенам.

Известны штаммы бактерий рода Pseudomonas, обладающие антагонистической активностью по отношению к грибным фитопатогенам, используемые для получения препаратов против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами .

Известна питательная среда LB , являющаяся одной из основных для культивирования бактерий рода Pseudomonas - продуцентов веществ с фунгицидной активностью и состоящая, г/л:

Пептон - 10

Дрожжевой экстракт - 5

Натрий хлористый - 10

Вода водопроводная до 1 л.

Недостатком питательной среды является высокая стоимость, так как в ее составе присутствует такой дорогостоящий компонент, как пептон (примерно, 700 руб/кг).

Известна питательная среда Кинг В, принятая за прототип, также применяемая для культивирования бактерий рода Pseudomonas. В нее входят пептон, глицерин, различные минеральные соли, г/л:

Пептон - 20

Глицерин - 10

К 2 HPO 4 - 1,5

MgSO 4 ·7H 2 O - 1,5

Вода дистиллированная до 1 л.

Ее недостатком также является высокая стоимость, связанная с наличием в ее составе такого дорогостоящего ингредиента, каким является пептон.

При промышленном производстве биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas, предназначенных для использования в растениеводстве, высокая стоимость питательной среды неизбежно приведет к удорожанию целевого продукта.

Технической задачей предполагаемого изобретения является удешевление питательной среды для культивирования бактерий рода Pseudomonas и увеличение выхода биомассы.

Поставленная техническая задача удешевления стоимости питательной среды для культивирования бактерий рода Pseudomonas и увеличения выхода биомассы решается использованием питательной среды следующего состава, г/л:

Автолизат отработанных пивных дрожжей 7-8 генерации (по сухому веществу) - 26,8

К 2 HPO 4 - 1,5

MgSO 4 ·7H 2 O - 1,5

Вода водопроводная до 1 л.

Отработанные пивные дрожжи 7-8 генерации не используются в производстве пива, так как клетки таких дрожжей уже не способны к осуществлению своей основной функции в процессе брожения; они также утрачивают и способность к размножению. Количество мертвых клеток в такой генерации достигает 89%, со слабой жизнедеятельностью - до 10%. В настоящее время отработанные пивные дрожжи не находят квалифицированного применения и, как правило, сливаются в канализацию. В то же время отработанные пивные дрожжи содержат в значительном количестве витамины группы В, РР и Е, а также все незаменимые аминокислоты.

Микробные культуры при их культивировании высокочувствительны к составу питательной среды. При удачном подборе всех компонентов по качественному и количественному составу, в частности набору аминокислот, среда обеспечивает достаточно быстрый рост и развитие популяции микроорганизмов и считается сбалансированной . В клеточном белке индивидуальные аминокислоты составляют 1-5% от всего белка, на основании чего можно приблизительно оценить количество аминокислот, необходимых в качестве факторов роста. Исключение составляет глутаминовая кислота и глутамин, которые количественно играют большую роль в аминокислотном метаболизме и содержание которых в среде должно значительно превышать содержание остальных аминокислот . В таблице 1 приведен определенный нами аминокислотный состав отработанных пивных дрожжей различных фирм - производителей пива, а также образца коммерческого пептона, предназначенного для использования в составе некоторых питательных сред в микробиологии.

Как следует из данных таблицы 1, в составе отработанных пивных дрожжей в значительном количестве присутствует глутаминовая кислота, причем ее содержание в процентном отношении оказывается более высоким, чем в пептоне. Следует отметить также и более высокий уровень содержания по сравнению с пептоном и всех незаменимых аминокислот, что свидетельствует о более сбалансированном аминокислотном составе предложенного компонента питательной среды.

Предлагаемую питательную среду готовят следующим образом.

Для получения автолизата отработанные пивные дрожжи 7-8 генерации подвергают термической обработке при 100°С в течение часа.

К дрожжевому автолизату добавляют минеральные компоненты, доводят объем полученной смеси до 1 л водопроводной водой и автоклавируют. Вносят посевной материал (40 мл культуры бактерий Pseudomonas). Штамм выращивают в течение 48 часов при 28-30°С с постоянной аэрацией. Затем определяют в культуральной жидкости титр известным методом разведении .

Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава. К 26,8 г дрожжевого автолизата добавляют 1,5 г К 2 НРО 4 и 1,5 г MgSO 4 ·7H 2 O, доводят объем полученной смеси до 1 л водопроводной водой и автоклавируют. Затем в питательную среду засевают 40 мл культуры бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 . Ферментацию осуществляют в течение 48 часов при 28-30°С при постоянной аэрации. Титр культуральной жидкости в конце ферментации составляет 5·10 11 КОЕ/мл.

При аналогичных условиях проводится культивирование штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 на известной среде Кинг В. Численность микроорганизмов по окончании процесса культивирования составила 3·10 10 КОЕ/мл.

Пример 2. Питательную среду готовят вышеописанным способом по примеру 1 и засевают 40 мл культуры Pseudomonas putida ИБ 17 . Ферментацию проводят аналогичным способом по примеру 1. Титр культуральной жидкости в конце ферментации составляет 5·10 11 КОЕ/мл.

При аналогичных условиях проводится культивирование штамма Pseudomonas putida ИБ 17 на известной среде Кинг В. Численность микроорганизмов по окончании процесса культивирования составила 6·10 10 КОЕ/мл.

В таблице 2 приведены результаты культивирования бактерий рода Pseudomonas на среде Кинг В (по прототипу) и предлагаемой среде. Как видно, наиболее высокий титр бактерий рода Pseudomonas поддерживается в пробах, где питательная среда содержит вместо пептона и глицерина автолизат отработанных пивных дрожжей 7-8 генерации.

Пример 3. Проверка сохранения антагонистической активности штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, выращенного на предлагаемой среде.

На пластинки глюкозопептонного агара (глюкоза - 5 г, пептон - 5 г, агар - 15 г, К 2 НРО 4 - 2 г, КН 2 РО 4 - 4 г, вода дистиллированная - 1 л) высевают сплошным газоном суспензию спор грибного фитопатогена (Bipolaris sorokiniana). Затем на эти же пластинки уколом сажают бактерии штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, выращенные на предлагаемой среде. Чашки инкубируют при 28°С в течение 3-х суток.

Учет антагонистической активности проводят по среднему диаметру зоны отсутствия или подавления роста тест-гриба вокруг колонии штамма. Для Bipolaris sorokiniana он составил 55 мм.

При аналогичных условиях производят учет антагонистической активности штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, культивирование которого происходило на известной среде Кинг В. Средний диаметр зоны подавления роста гриба составил 55 мм.

Пример 4. Проверку сохранения и учет антагонистической активности штамма Pseudomonas putida ИБ 17, выращенного на предлагаемой среде, проводят вышеописанным способом по примеру 3. Средний диаметр зоны подавления роста тест-гриба составил 22 мм.

При аналогичных условиях проводят учет антагонистической активности штамма Pseudomonas putida ИБ 17, культивирование которого производилось на известной среде Кинг В. Средний диаметр зоны подавления роста гриба составил 22 мм.

Результаты приведены в таблице 2 и свидетельствуют о сохранении антагонистического действия штаммов бактерий рода Pseudomonas, выращенных на предлагаемой среде, на тест-культуру фитопатогенного гриба Bipolaris sorokiniana.

Таким образом, применение предлагаемой питательной среды, содержащей в качестве источника аминокислот автолизат отработанных пивных дрожжей 7-8 генерации, для культивирования бактерий рода Pseudomonas, обладающих антагонистической активностью по отношению к грибным фитопатогенам, позволяет существенно снизить себестоимость биопрепаратов на основе этих микроорганизмов и повысить выход биомассы.

Литература

1. Патент РФ 2203945, 7 С12N 1/20, А01N 63/00 // (С12N 1/20, С12R 1:38). Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами. / Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Силищев Н.Н., Мелентьев А.И., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф.; заявлено 17.08.2001; опубл. 10.05.2003. Бюл.13.

2. Патент РФ 2213774, 7 С12N 1/20 // (С12N 1/20, С12R 1:40). Штамм бактерий Pseudomonas putida для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами. / Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Силищев Н.Н., Мелентьев А.И., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф., Исаев Р.Ф.; заявлено 25.03.2002; опубл. 10.10.2003. Бюл.28.

3. Патент РФ 2130265, 6 А01N 63/00 // (А01С 1/00). Способ борьбы с возбудителями заболеваний растений. / Дашкевич B.C., Дашкевич Н.Ю., Ашмарина Л.Ф., Шушаро А.И., заявлено 29.12.97; опубл. 20.05.99. Бюл.14.

4. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. // J.Lab. Clin. Med. - 1954. - V.44. - P.301-307.

5. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев, «Наукова думка», 1990. - С.222.

6. Гуревич Ю.Л. Устойчивость и регуляция размножения в микробных популяциях. - Новосибирск, Наука, 1984. - С.28-29.

7. Манаков М.Н., Победимский Д.Г. Теоретические основы микробиологических производств. - М.: Агропромиздат, 1990. - С.180-181.

8. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978. - С.147-148.

9. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. - М.: Дрофа, 2004. - 256 с.

Таблица 1
Аминокислотный состав пептона и отработанных дрожжей различных пивоваренных производств
	Отработанные дрожжи (Уфа, Efes)	Отработанные дрожжи (Стерлитамак, Шихан-Хайнекен)	Отработанные дрожжи (Новотроицк, ПИТ)	пептон
Треонин	5,56%	5,45%	5,25%	2,09%
Валин	4,67%	4,34%	5,34%	2,22%
Метионин	1,83%	1,85%	2,00%	0,96%
Изолейцин	5,22%	4,50%	5,30%	1,81%
Лейцин	6,93%	6,31%	7,03%	2,98%
Тирозин	4,28%	3,72%	4,44%	0,78%
Фенилаланин	4,97%	4,86%	5,37%	2,34%
Лизин	11,07%	10,57%	11,71%	4,85%
Цистин	1,24%	1,72%	1,55%	0,23%
Серин	5,35%	5,86%	5,87%	3,50%
Глутаминовая к-та	15,20%	13,70%	13,40%	11,35%
Пролин	5,40%	6,23%	4,87%	14,46%
Глицин	5,78%	5,33%	5,36%	27,33%
Аланин	8,37%	7,42%	7,80%	8,97%
Гистидин	3,34%	2,00%	3,47%	0,75%
Аргинин	0,79%	6,54%	1,09%	9,52%
Аспарагиновая к-та	10,00%	9,60%	10,15%	5,86%

Питательная среда для культивирования бактерий рода Pseudomonas, используемых для получения антифунгальных препаратов, содержащая источник аминокислот, К 2 НРО 4 , MgSO 4 ·7Н 2 О и воду, отличающаяся тем, что в качестве источника аминокислот она содержит автолизат отработанных пивных дрожжей 7-8 генерации, а воды - воду водопроводную при следующем соотношении компонентов, г/л:

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, в частности к эпидемиологии и микробиологии, и может быть использовано при эпидемиологическом надзоре за гнойно-септическими инфекциями для выявления госпитальных микробных ассоциаций.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологически активным комплексам, препаратам для медицины, сельского хозяйства и пищевой промышленности, и может быть использовано для приготовления лечебно-профилактических препаратов на основе живых лакто- и бифидобактерий.